论文部分内容阅读
J亚群禽白血病（AL-J）是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一种肿瘤性且免疫抑制性传染病,该病给养禽业带来极大的危害并造成严重的经济损失。近来研究表明环状RNA（circular RNA）在肿瘤疾病的发生发展中起着至关重要的作用。由于目前没有环状RNA调控ALV-J诱导肿瘤形成方面的报道,因此本研究通过探讨肿瘤鸡中差异高表达的环状RNA所调控肿瘤形成的作用机制,为临床上防控AL-J提供新的理论依据。第一部分:ALV-J感染宿主差异表达的环状RNA的筛选本研究选取30只ALV-J高抗性鸡（F2代）的子代鸡（F3代）,于1日龄用NX0101攻毒,同时用同品系同代次的易感鸡的子代鸡做对照。攻毒后,用RT-PCR和病毒分离方法每周进行ALV-J检测,跟踪检测持续到第20周,选取抗性组的每次检测结果均为阴性的鸡3只和易感组每次检测均为阳性且有肿瘤病变的鸡3只进行环状RNA测序。对所鉴定到的环状RNA进行分析表明鸡中共存在5种类型的环状RNA,即exonic、intronic、antisense、sense overlapping和intergenic,且exonic环状RNA所占的比例最大,而intronic环状RNA所占的比例最小。鸡的环状RNA与人的环状RNA的同源性是63.82%,而与鼠的同源性是59.80%。利用生物学软件分析差异表达的环状RNA,结果表明共存在2808个差异表达的环状RNA,对肿瘤鸡中差异高表达的环状RNA进行GO基因注释,结果表明这些环状RNA执行信使RNA新陈代谢过程、细胞发生发展等功能,所处的细胞成分是胶原蛋白三聚体和细胞连接,并参与核苷磷酸绑定、核苷酸绑定等生物过程。KEGG生物通路富集分析表明这些环状RNA主要参与半胱氨酸和蛋氨酸新陈代谢信号通路。同时我们又筛选出12个在ALV-J高抗鸡中差异高表达的环状RNA,暗示这12个环状RNA可能是非常重要的参与宿主抗ALV-J感染的关键基因。GO基因注释结果表明这些环状RNA执行分子功能调节、通道调控活性等功能,所处在转移酶复合物等细胞成分上,并参与调节活性氧等生物过程。KEGG生物通路富集分析显示这些环状RNA主要参与RNA转运、FOXO信号通路和m TOR信号通路。第二部分:环状RNA circ-Vav3“海绵”吸附gga-miR-375的验证本研究以前期在肿瘤鸡中筛选出来的差异高表达的环状RNA为基础,用生物信息学软件对其可能吸附的miRNA进行预测。本实验室前期研究表明gga-miR-375在ALV-J致瘤过程中起重要作用,在预测环状RNA可能吸附的miRNA的过程中,发现其中一个环状RNA circ-Vav3共有6个和gga-miR-375结合的种子序列,于是本研究采用RNA免疫共沉淀（RIP）,RNA pulldown和RNA原位杂交（RNA-FISH）三种试验方法对其circ-Vav3“海绵”吸附gga-miR-375进行验证,结果表明circ-Vav3“海绵”吸附gga-miR-375,并且circ-Vav3定位在细胞质中,gga-miR-375定位在细胞质和细胞核中,circ-Vav3是在细胞质中吸附gga-miR-375。第三部分:Circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴线促进ALV-J诱导宿主肿瘤形成的机制研究在验证了环状RNA circ-Vav3“海绵”吸附gga-miR-375的基础上,本研究继续探索其所参与致瘤过程的调控机制。双荧光素酶报告基因试验验证了YAP1是gga-miR-375的靶标基因,并且gga-miR-375的过表达可以抑制YAP1的蛋白表达水平。DF-1细胞中过表达YAP1可以促进细胞的迁移,并且可以促进上皮细胞间充质转化（EMT）通过上调间充质细胞的分子标记物Fibronectin和N-cadherin和下调上皮细胞的分子标记物E-cadherin。DF-1细胞中同时过表达circ-Vav3和gga-miR-375,结果显示同时过表达circ-Vav3和gga-miR-375可以促进YAP1、Fibronectin和N-cadherin的转录和蛋白表达水平,降低上皮细胞的分子标记物E-cadherin的转录和蛋白表达水平。为了充分验证结果的准确性,DF-1细胞攻毒试验表明ALV-J NX0101株能够上调circ-Vav3、YAP1、Fibronectin和N-cadherin的蛋白与转录水平,下调gga-miR-375和E-cadherin的蛋白与m RNA水平。最后收集临床上ALV-J感染的肿瘤鸡的肝脏和正常鸡的肝脏进行实时荧光定量PCR试验来进一步检测上述核心基因circ-Vav3、gga-miR-375、YAP1、Fibronectin、N-cadherin和E-cadherin的表达趋势,实验结果和上述体外试验的基因表达趋势一致。因此,由以上试验得出结论:circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴线调控EMT通过上调间充质细胞的分子标记物Fibronectin和N-cadherin和下调上皮细胞的分子标记物E-cadherin,从而来促进ALV-J的致瘤作用。综上所述,本研究首次证明circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴线诱导EMT通过上调Fibronectin和N-cadherin的蛋白与转录水平,下调E-cadherin的蛋白与转录水平从而诱导宿主产生肿瘤。