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类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种导致关节炎症和破坏的慢性滑膜疾病，其残疾率高、预后差、治愈率低，给社会和家庭带来沉重的负担，已成为国内外重要的公共卫生问题。RA的发病机制复杂，环境、遗传、感染和内分泌等因素均可影响该病的发生发展，其中遗传学因素可以解释RA大约50-60％的易感性。在多个水平都存在RA的生物标志物，从遗传学角度研究RA的发病机理和寻找新的早期易感标志物是目前风湿病学界的研究热点和方向。循环细胞因子是非常有前景的一类潜在标志物，而蛋白芯片技术可以快速、高效、准确的分析血浆细胞因子表达谱，利用此方法可以系统地筛选RA相关的血浆潜在生物标志物。此外，GWAS问世以来已经鉴定了很多功能性的遗传位点，这些位点可以作为潜在生物标志物，需要对它们进行进一步的筛选与评价。这些SNP大部分都处于非编码区，关于非编码区SNPs的功能机制尚不清楚，很多与RA有关的功能性SNPs还没有被挖掘出来，因此有必要对RA的GWAS结果进行全面的功能注释来挖掘RA有关的遗传位点。另外，GWAS已经鉴定出一百多个与RA相关的SNPs，但这些SNPs对RA产生影响的基因或功能性DNA元件往往是未知的，eQTL数据库只能分析SNPs与mRNA的关联性，所以需要一种新的手段或方法(SMR)将现有的GWAS和eQTL数据综合分析来筛选RA相关的新的易感基因并探讨其潜在的功能意义。
第一章
目的:利用细胞因子芯片技术检测RA有关的血浆细胞因子表达谱并进一步探讨其在RA发病过程中所起的作用。
材料和方法:首先用人细胞因子抗体440芯片对18名受试者(9例RA病例和9例对照)进行了血浆细胞因子蛋白芯片分析;然后用ELISA对筛选的差异血浆细胞因子在新的独立样本(40例RA病例和40例对照)中验证;接下来在类风湿性关节炎纤维样滑膜细胞(MH7A)和T淋巴细胞(Jurkat)中进行体外功能实验，明确血浆细胞因子对RA的致病机理;最后利用ROC曲线和曲线下面积(AUC)对血浆细胞因子进行评价。
结果:细胞因子芯片从RA病例和对照血浆中共筛选到7个差异细胞因子，根据信号强度及统计学差异我们最终选择PDGF-BB进行后续实验。ELISA结果显示RA病例中PDGF-BB的表达水平明显高于对照组(P=0.005)，细胞实验结果显示，PDGF-BB可以明显促进MH7A细胞的增殖，可能是通过抑制细胞凋亡和改变细胞周期进程实现的，此外还可以明显促进细胞迁移。PDGF-BB对Jurkat细胞的功能要弱于MH7A，虽然可以促进Jurkat细胞增殖，但对细胞凋亡、周期和活化没有明显的影响，不过PDGF-BB可以明显促进炎症因子分泌来影响T细胞功能。ROC曲线及AUC表明PDGF-BB评估RA的准确性不高。
结论:本研究评估了与RA相关的血浆细胞因子表达谱，并结合ELISA的方法证实了PDGF-BB在RA中高表达。体外实验证实PDGF-BB可以通过促进Jurkat细胞增殖和炎症因子分泌来影响T细胞活性;同时通过促进滑膜细胞的增殖和迁移、抑制其凋亡和改变周期进程来影响RA的发病及进展。PDGF-BB用于评估RA的诊断价值比较低，不足以作为RA的潜在生物标志物。
第二章
目的:对GWAS研究中RA有关的SNPs进行全面的功能注释以探寻新的遗传位点并阐明其生物学功能。
材料和方法:从公共数据库中下载RA有关的GWAS数据，按照P＜5×10-8的标准筛选有意义的SNPs，然后利用在线工具UCSC对这些SNPs进行注释以确定其功能分区。编码区的SNPs主要分析错义突变的SNPs对蛋白质的损伤作用;3-UTR区的SNPs，利用MirSNP数据库预测与UTR序列的结合亲和力;内含子区域的SNPs，首先确定这些SNPs是否处于增强子区域，然后针对启动子和增强子区域的所有SNPs，利用在线工具SNP2TFBS预测可以影响转录因子结合的SNPs，并观察这些SNPs主要富集的转录因子。最后将富集的转录因子在我们的内部样本中(RA病例和对照)观察差异表达情况。
结果:我们根据基因位置对11179个亚洲特异性和22959个欧洲特异性的SNPs进行了注释。在编码区共鉴定了19个亚洲特异性和32个欧洲特异性的错义突变的SNPs在一种算法中可能对蛋白质有损伤，其中有3个SNPs:rs3819268、rs34536443和rs14398用三种算法都可以检测到对蛋白质的损伤。亚洲人群和欧洲人群3-UTR区分别鉴定了36和37个SNPs与miRNA结合影响基因靶向调控。其中亚洲人群中的SNPrs9104可能通过与miRNAhsa-miR-4474-5p结合来调控靶基因BTN3A2，而欧洲人群鉴定到的遗传位点rs1573298可能是通过与miRNAhsa-miR-664a-3p的结合来对TRIM1O基因进行调控。启动子区域分别有9个亚洲特异性和43个欧洲特异性的SNPs可以影响转录因子结合，分别富集于7/7个不同的转录因子上。内含子区域分别有1162个亚洲特异性和3261个欧洲特异性的SNPs具有增强子活性，可以影响转录因子结合的分别有281个(亚洲)和839个(欧洲)，这些SNPs分别富集于8/21个转录因子上。富集的转录因子在内部样本(25个RA病例和18个对照)中差异表达的分别有6个(亚洲)和8个(欧洲)。
结论:我们从亚洲人群共鉴定了19个错义SNPs，36个3-UTRSNPs，9个启动子SNPs和281增强子SNPs，这些功能性SNPs影响的基因有6个可以在RA病例对照间差异表达。在欧洲人群共鉴定了32个错义SNPs，37个3-UTRSNPs，43个启动子SNPs和839增强子SNPs，共有8个对应的基因在RA病例和对照之间差异表达。
第三章
目的:利用基于综合数据的孟德尔随机化(summary data-based Mendelian randomization，SMR)的方法鉴定RA有关的新的易感基因，并探讨其生物学意义。
材料和方法:GWAS数据库来源于最大的一项关于RA的meta分析，四个eQTL数据库分别来自Westra等人对外周血样本完成的一项meta分析中包含的数据、GAGE的外周血样本数据、来自GTEx项目的10个脑区的meta分析的eQTL数据和来自Geuvadis等人总结的淋巴细胞系的eQTL数据。利用SMR将GWAS数据库和eQTL数据库的信息进行分析，然后将得到的基因进行富集分析和蛋白交互作用分析，最后在三个RA有关的GEO数据库和我们自己的内部样本(RA病例和对照)进行验证。
结果:用SMR的方法分别从亚洲、欧洲和跨种族人群中筛选到8、34和32个RA有关的易感基因。这些基因中，三个人群分别有2、18和9个基因在GWAS研究中的P值大于5×10-8，可能是GWAS分析中遗漏的RA有关的新的易感基因。所有筛选的基因中，在GEO数据库和我们自己的内部样本中得到验证有42个，其中高度验证的有11个，包括2个亚洲特异性(PADI4和HLA-DQB1)、6个欧洲特异性(FCRL3、FADS1、SYNGR1、TRAF1、ABCF1和CD40)和9个跨种族基因(IFNAR2、CD226、FADS1、FCRL3、ABCF1、SYNGR1、FLOT1、CD40和PADI4)，6个基因(FCRL3、FADS1、SYNGR1、TRAF1、IFNAR2和CD226)在GWAS研究中不属于顶端基因，即P值大于5×10-8，只有IFNAR2在以往的研究中没有被报道过与RA关联。此外，还有一些基因虽然没有在GEO数据库和内部样本中得到验证，但也不能排除与RA无关联，这些基因包括3个亚洲特异性、8个欧洲特异性和9个跨种族基因。
结论:本研究用SMR的方法分别从亚洲、欧洲和跨种族人群中筛选到8、34和32个RA有关的易感基因。在GEO数据库和内部样本库中可以得到验证的基因共有42个，其中高度证实的有11个，包含2个亚洲特异性、6个欧洲特异性和9个跨种族基因。其中P值大于5×10-8的基因包括FCRL3、FADS1、SYNGR1、TRAF1、IFNAR2和CD226。该结果不仅大大提高了我们对RA遗传易感性的认识，而且为两个种族类风湿性关节炎的种族遗传同质性和异质性研究提供了重要的见解。
第一章
目的:利用细胞因子芯片技术检测RA有关的血浆细胞因子表达谱并进一步探讨其在RA发病过程中所起的作用。
材料和方法:首先用人细胞因子抗体440芯片对18名受试者(9例RA病例和9例对照)进行了血浆细胞因子蛋白芯片分析;然后用ELISA对筛选的差异血浆细胞因子在新的独立样本(40例RA病例和40例对照)中验证;接下来在类风湿性关节炎纤维样滑膜细胞(MH7A)和T淋巴细胞(Jurkat)中进行体外功能实验，明确血浆细胞因子对RA的致病机理;最后利用ROC曲线和曲线下面积(AUC)对血浆细胞因子进行评价。
结果:细胞因子芯片从RA病例和对照血浆中共筛选到7个差异细胞因子，根据信号强度及统计学差异我们最终选择PDGF-BB进行后续实验。ELISA结果显示RA病例中PDGF-BB的表达水平明显高于对照组(P=0.005)，细胞实验结果显示，PDGF-BB可以明显促进MH7A细胞的增殖，可能是通过抑制细胞凋亡和改变细胞周期进程实现的，此外还可以明显促进细胞迁移。PDGF-BB对Jurkat细胞的功能要弱于MH7A，虽然可以促进Jurkat细胞增殖，但对细胞凋亡、周期和活化没有明显的影响，不过PDGF-BB可以明显促进炎症因子分泌来影响T细胞功能。ROC曲线及AUC表明PDGF-BB评估RA的准确性不高。
结论:本研究评估了与RA相关的血浆细胞因子表达谱，并结合ELISA的方法证实了PDGF-BB在RA中高表达。体外实验证实PDGF-BB可以通过促进Jurkat细胞增殖和炎症因子分泌来影响T细胞活性;同时通过促进滑膜细胞的增殖和迁移、抑制其凋亡和改变周期进程来影响RA的发病及进展。PDGF-BB用于评估RA的诊断价值比较低，不足以作为RA的潜在生物标志物。
第二章
目的:对GWAS研究中RA有关的SNPs进行全面的功能注释以探寻新的遗传位点并阐明其生物学功能。
材料和方法:从公共数据库中下载RA有关的GWAS数据，按照P＜5×10-8的标准筛选有意义的SNPs，然后利用在线工具UCSC对这些SNPs进行注释以确定其功能分区。编码区的SNPs主要分析错义突变的SNPs对蛋白质的损伤作用;3-UTR区的SNPs，利用MirSNP数据库预测与UTR序列的结合亲和力;内含子区域的SNPs，首先确定这些SNPs是否处于增强子区域，然后针对启动子和增强子区域的所有SNPs，利用在线工具SNP2TFBS预测可以影响转录因子结合的SNPs，并观察这些SNPs主要富集的转录因子。最后将富集的转录因子在我们的内部样本中(RA病例和对照)观察差异表达情况。
结果:我们根据基因位置对11179个亚洲特异性和22959个欧洲特异性的SNPs进行了注释。在编码区共鉴定了19个亚洲特异性和32个欧洲特异性的错义突变的SNPs在一种算法中可能对蛋白质有损伤，其中有3个SNPs:rs3819268、rs34536443和rs14398用三种算法都可以检测到对蛋白质的损伤。亚洲人群和欧洲人群3-UTR区分别鉴定了36和37个SNPs与miRNA结合影响基因靶向调控。其中亚洲人群中的SNPrs9104可能通过与miRNAhsa-miR-4474-5p结合来调控靶基因BTN3A2，而欧洲人群鉴定到的遗传位点rs1573298可能是通过与miRNAhsa-miR-664a-3p的结合来对TRIM1O基因进行调控。启动子区域分别有9个亚洲特异性和43个欧洲特异性的SNPs可以影响转录因子结合，分别富集于7/7个不同的转录因子上。内含子区域分别有1162个亚洲特异性和3261个欧洲特异性的SNPs具有增强子活性，可以影响转录因子结合的分别有281个(亚洲)和839个(欧洲)，这些SNPs分别富集于8/21个转录因子上。富集的转录因子在内部样本(25个RA病例和18个对照)中差异表达的分别有6个(亚洲)和8个(欧洲)。
结论:我们从亚洲人群共鉴定了19个错义SNPs，36个3-UTRSNPs，9个启动子SNPs和281增强子SNPs，这些功能性SNPs影响的基因有6个可以在RA病例对照间差异表达。在欧洲人群共鉴定了32个错义SNPs，37个3-UTRSNPs，43个启动子SNPs和839增强子SNPs，共有8个对应的基因在RA病例和对照之间差异表达。
第三章
目的:利用基于综合数据的孟德尔随机化(summary data-based Mendelian randomization，SMR)的方法鉴定RA有关的新的易感基因，并探讨其生物学意义。
材料和方法:GWAS数据库来源于最大的一项关于RA的meta分析，四个eQTL数据库分别来自Westra等人对外周血样本完成的一项meta分析中包含的数据、GAGE的外周血样本数据、来自GTEx项目的10个脑区的meta分析的eQTL数据和来自Geuvadis等人总结的淋巴细胞系的eQTL数据。利用SMR将GWAS数据库和eQTL数据库的信息进行分析，然后将得到的基因进行富集分析和蛋白交互作用分析，最后在三个RA有关的GEO数据库和我们自己的内部样本(RA病例和对照)进行验证。
结果:用SMR的方法分别从亚洲、欧洲和跨种族人群中筛选到8、34和32个RA有关的易感基因。这些基因中，三个人群分别有2、18和9个基因在GWAS研究中的P值大于5×10-8，可能是GWAS分析中遗漏的RA有关的新的易感基因。所有筛选的基因中，在GEO数据库和我们自己的内部样本中得到验证有42个，其中高度验证的有11个，包括2个亚洲特异性(PADI4和HLA-DQB1)、6个欧洲特异性(FCRL3、FADS1、SYNGR1、TRAF1、ABCF1和CD40)和9个跨种族基因(IFNAR2、CD226、FADS1、FCRL3、ABCF1、SYNGR1、FLOT1、CD40和PADI4)，6个基因(FCRL3、FADS1、SYNGR1、TRAF1、IFNAR2和CD226)在GWAS研究中不属于顶端基因，即P值大于5×10-8，只有IFNAR2在以往的研究中没有被报道过与RA关联。此外，还有一些基因虽然没有在GEO数据库和内部样本中得到验证，但也不能排除与RA无关联，这些基因包括3个亚洲特异性、8个欧洲特异性和9个跨种族基因。
结论:本研究用SMR的方法分别从亚洲、欧洲和跨种族人群中筛选到8、34和32个RA有关的易感基因。在GEO数据库和内部样本库中可以得到验证的基因共有42个，其中高度证实的有11个，包含2个亚洲特异性、6个欧洲特异性和9个跨种族基因。其中P值大于5×10-8的基因包括FCRL3、FADS1、SYNGR1、TRAF1、IFNAR2和CD226。该结果不仅大大提高了我们对RA遗传易感性的认识，而且为两个种族类风湿性关节炎的种族遗传同质性和异质性研究提供了重要的见解。