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研究目的:宫颈癌(cervical cancer)是我国最常见的妇科恶性肿瘤之一,据中国国家癌症登记中心2018年最新数据估算,2014年我国宫颈癌新发病例可达10.2万例,死亡人数约为3.04万。此外,目前普遍认为高危型人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus)持续感染是宫颈癌发生的必要条件。但HPV感染的患者只有一部分会进展为宫颈癌,这提示我们还有其他的一些重要因素参与到宫颈癌的发生发展过程中。目前,随着经济水平的提高,妇女保健意识的增强,宫颈癌筛查的普及以及HPV疫苗的应用,宫颈癌在发达国家的死亡率已呈现出下降的趋势。越来越多的宫颈癌患者在早期被发现,增加了患者手术治愈的机会。但近20年的临床流行病学调查统计发现,宫颈癌患者呈现出年轻化趋势,患者对治疗后生活质量的要求更加迫切。在这种情况下,如何全面评估患者病情,选择合理、个体化的治疗方案,便成为妇科肿瘤医生亟待解决的问题。除此之外,现在临床上依然有许多患者在确诊时便已是晚期,失去了手术治疗的机会,但目前还缺少针对宫颈癌的靶向治疗药物。因此,深入研究宫颈癌的发生发展分子机制,寻找新的预防、诊断以及潜在的治疗靶点便显得至关重要。已有大量的研究显示circRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用,然而其在宫颈癌中的研究却鲜有报道。本研究目的是探索circRNA在宫颈癌中的作用机制及其在宫颈癌中的潜在临床意义。研究方法:1、本研究借助成熟的基因芯片技术,以宫颈永生化上皮细胞系H8及宫颈癌细胞系SiHa为样本,筛选出在两种细胞系中差异表达的circRNAs。接下来我们通过qRT-PCR及Sanger Sequencing方法对差异表达明显的circRNAs进行验证。我们挑选了其中差异表达最明显的circNRIP1进行了进一步的研究。我们通过qRT-PCR检测了circNRIP1在40对宫颈癌组织及癌旁组织中的表达,并分析其表达水平与患者临床病理参数的关系。2、我们构建了circNRIP1过表达及敲减慢病毒载体,并成功构建了慢病毒稳转宫颈癌HeLa和SiHa细胞系。接下来我们通过CCK-8实验及EdU实验检测circNRIP1过表达或敲减后细胞的增殖能力的变化;细胞划痕实验检测circNRIP1表达水平对细胞迁移能力的影响;Transwell Matrigel实验检测circNRIP1表达水平对细胞侵袭能力的影响。3、通过基于Arraystar自带miRNA预测软件以及生物信息学软件RNAhybrid,我们筛选出5个与circNRIP1具有结合位点的mi RNAs。通过RT-PCR我们检测了宫颈癌细胞系中circNRIP1表达水平变化对这5个miRNAs表达水平的影响。我们发现miR-629-3p可以被circNRIP1负性调控。我们又通过进一步双荧光素酶实验验证了两者之间的直接相互作用。接下来,我们通过qRT-PCR检测了宫颈癌组织及癌旁组织中miR-629-3p的表达水平,并分析其表达水平与患者临床病理参数的关系以及与circNRIP1表达水平的相关性。我们下一步通过细胞功能实验包括CCK8实验、EdU实验、细胞划痕实验以及Transwell Matrigel实验检测了miR-629-3p对宫颈癌细胞系生物学行为的影响。之后我们通过生物信息学分析软件TargetScan预测了miR-629-3p的潜在靶基因PTP4A1,所以我们接下来通过qRT-PCR、Western Blot检测了miR-629-3p对PTP4A1的mRNA及蛋白表达的影响。通过双荧光素酶实验证实了两者之间的相互作用。最后我们通过circNRIP1及miR-629-3p共转染宫颈癌细胞系、细胞功能实验以及Western Blot实验检测miR-629-3p是否能够恢复circNRIP1对细胞功能及蛋白表达的影响。最后通过在裸鼠皮下注射circNRIP1过表达HeLa细胞及对照细胞,构建裸鼠荷瘤模型,观测小鼠体内移植瘤的变化以及组化结果,验证circNRIP1在体内宫颈癌细胞中的作用。研究结果:1.circNRIP1在宫颈癌细胞系SiHa中表达水平高于宫颈永生化上皮细胞系H8,进一步在宫颈癌组织及癌旁组织中验证,发现circNRIP1在宫颈癌组织中表达水平高于癌旁组织,且与淋巴脉管间质浸润具有相关性,差异均具有统计学意义。2.circNRIP1过表达可以促进宫颈癌细胞的增殖能力,而敲低circNRIP1的表达水平则会降低宫颈癌细胞的增殖能力。细胞划痕实验证实了circNRIP1能够促进细胞迁移,Transwell Matrigel实验结果显示circNRIP1过表达可以增加穿膜细胞数,即促进宫颈癌细胞的侵袭能力,而circNRIP1敲减则具有相反的作用。3.生信分析软件结果显示circNRIP1与miR-629-3p具有潜在的结合位点。进一步qRT-PCR实验证实了circNRIP1可以负性调控miR-629-3p的表达水平,双荧光素酶实验结果显示miR-629-3p可以显著降低野生型circNRIP1载体的荧光强度,而不影响突变型载体的荧光强度。进一步对转染了miR-629-3p、inh-629-3p以及其各自对照组的细胞进行了生物学行为检测,CCK8及EdU结果显示miR-629-3p抑制了细胞的增殖,细胞划痕实验显示miR-629-3p组细胞迁移速度低于对照组,Transwell Matrigel实验结果显示miR-629-3p组穿膜细胞数与对对照组相比有所减少。于此同时inh-629-3p对宫颈癌细胞系的影响与miR-629-3p正相反,差异均具有统计意义。接下来TargetScan数据库预测PTP4A1是miR-629-3p的潜在靶基因,qRT-PCR、Western Blot结果显示miR-629-3p可以调控PTP4A1 mRNA及其蛋白的表达。双荧光素酶实验显示,miR-629-3p可以降低WT-PTP4A1组的荧光强度而不影响MUT-PTP4A1组的荧光强度。最后我们通过circNRIP1及miR-629-3p共转染宫颈癌细胞系,发现miR-629-3p可以降低circNRIP1过表达对细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用,而inh-629-3p可以恢复sh-circ NRIP1对细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制。Western Blot实验证实了circNRIP1可以调控miR-629-3p靶标PTP4A1以及其下游ERK1/2通路相关蛋白的表达水平。最后,裸鼠荷瘤实验发现circNRIP1可以促进移植瘤在小鼠体内的生长,且免疫组化结果显示circNRIP1过表达组的移植瘤中PTP4A1的表达水平高于其对照组。研究结论:1.CircNRIP1在宫颈癌癌组织中呈高表达且与淋巴脉管间质浸润具有相关性。2.CircNRIP1能够促进宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。3.MiR-629-3p在宫颈癌组织中低表达,并能够通过负性调控靶基因PTP4A1调控ERK1/2通路,从而抑制宫颈癌细胞的迁移及侵袭能力。4.CircNRIP1通过负性调控miR-629-3p从而调控PTP4A1的表达,并通过ERK1/2通路促进宫颈癌细胞的迁移及侵袭。