本论文的研究分两部分。第一部分为a-半乳糖苷酶Aga2的蛋白结晶和结构研究,第二部分为固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)Y6来源的八氢番茄红素脱氢酶Cr-tIRa结晶条件研究。α-半乳糖苷酶是一类重要的糖苷酶,催化水解α-半乳糖苷键,某些种类的α-半乳糖苷酶还能进行转糖基反应。己发现的该类酶转糖基产物键型以Gala1-3和Galα1-6为主,仅有本实验室报道的短双歧杆菌(Bifobbacterium breve)203和一种乳酸杆菌及甘露子、脆弱拟杆菌来源的α-半乳糖苷酶能够催化合成Gala1-4键型。Galα1-4存在于细胞表面糖链如志贺毒素受体Gb3糖链(globotriose,Galα1-4Ga1β1-4Glc)及肿瘤细胞表面抗原Globo-H中,体外合成Galα1-4结构的糖链,在抗菌药物及肿瘤疫苗等药用寡糖的开发研究中具有重要意义。本实验室前期通过随机突变结合定点突变得到转苷活性提高的α-半乳糖苷酶突变酶V564N,该突变酶及原始酶均能以甲基乳糖为糖基受体,通过糖苷酶法一步反应同时合成a-Gal抗原和globotriose衍生物,填补了糖苷酶法合成globotriose衍生物的空白。Aga2对不同糖基受体尤其是以甲基乳糖和乳糖为受体具有明显的区域选择性。当以蜜二糖为糖基受体时,专一性合成Gala1-4键型。现有的α-半乳糖苷酶的晶体结构研究主要集中在对其水解性质的阐释,目前尚无文献报道解释糖苷酶转糖基区域选择性的分子机理。已知晶体结构的α-半乳糖苷酶与Aga2同源性较低,利用结构模拟不能完全解释Aga2的V564N突变导致的转糖基活性提高以及糖基受体的区域选择性等酶催化反应特征。本文对Aga2进行了重组表达及纯化,使用15个结晶筛选试剂盒,共600多个条件进行筛选,在试剂盒 PEGRx-2 33(4%2-propano1、0.1 M Bis-Tris pH 9.0、20%PEG5000)得到了理想的结晶条件,对该条件优化后获得了分辨率3.0A的晶体。通过X-射线晶体衍射以及分子置换法最终解析了其晶体结构。Aga2晶体由四个完全相同的单体以空间轴垂直对称形式构成了一个紧密四聚体,每个单聚体具有一个大的“β-三明治”折叠型的N端结构域,一个(β/a)8桶状的/A催化结构域,以及由4个β-折叠片构成的C端结构域。由于获得没有底物共晶,活性区域A催化域的部分区域电子密度不可见。通过与LaaMe136A(PDB2xn0,结构中含有底物半乳糖)的晶体结构叠合,发现 Aga2 的 Asp537、Cys515、Gly518、Lys469、Asp355、Trp403、Asp471、Arg436、Asp356 与 LaMe136A 中识别稳定 α-半乳糖 6 个氧原子的相应氨基酸的种类和空间结构一致,推测以上氨基酸可能具有底物识别并稳定底物的功能。同时,与没有转糖基活性的糖苷酶AgaA(PDB4FNP)以及有微弱转糖基活性的AgaB(PDB4FNQ)等结构相比,Aga2具有更宽大而深邃的催化腔,推测该特征可能与其转糖基活性和底物区域选择性有关。我们正在尝试以半乳糖、乳糖、甲基乳糖为底物与Aga2共结晶,为进一步获得高质量Aga2晶体用于解释突变酶转苷效率提高的结构因素以及酶的转糖基区域选择性的分子机理奠定基础。本文第二部分主要对固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)来源的八氢番茄红素脱氢酶CrtIRa结晶条件进行了研究。类胡萝卜素是一种四萜化合物,含有9-13个共轭双键,具有非常重要的生物学功能和很高的药用价值。八氢番茄红素经三步、四步和五步脱氢可以分别产生链孢红素、番茄红素、3,4-二脱氢番茄红素三种类胡萝卜素。目前类胡萝卜素的生产主要依赖于植物提取,采用化学法合成效率很低,不能满足人们的需要,微生物发酵生产类胡萝卜素成为重要的发展方向。因此微生物的类胡萝卜素合成途径的研究具有重要的理论意义和应用价值。八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)是细菌、真菌中类胡萝卜素合成途径中的关键酶。现有对CrtI酶的报道主要局限于酶学性质的研究,而对催化合成类胡萝卜素的关键氨基酸位点及具体催化机制并不清楚。固氮红细菌(Rba.azotoformans)的类胡萝卜素合成途径以及该途径中的CrtIRa的连续五步脱氢催化特性为本实验室首次报道。该途径中的CrtIRa具有脱氢和异构的功能,预测为三次跨膜的膜整合蛋白,结晶难度大。己发表的CrtI晶体结构仅有来自于菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的CrtI,氨基酸序列相似性达到40%,该CrtI只有N端前30个氨基酸构成的一个跨膜域,用于结晶的蛋白也是截掉跨膜域的非全长蛋白,并且结构中有较多区域结构未完全解析,也无底物共晶结果。因此,筛选CrtIRa结晶条件得到全长蛋白晶体以及与底物的共晶具有重要意义,将为该蛋白晶体结构解析和催化机制阐明及酶分子定向改造提供依据。本论文使用实验室前期构建的pET-28b-crtIRa(crtIRa 基因来源于Rba.azotoformansY6)质粒,转化筛选出较好的表达菌株BL21(DE3),并表达纯化CrtI。纯化该蛋白的去垢剂使用策略为:选用终浓度1%-1.5%(w/v)的去垢剂 DDM(n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside)增溶 150,0OOg 超速离心 1h 后的膜蛋白沉淀,并用DDM完成镍亲和层析的初纯化,再分别使用低浓度的DDM、C8E4(n-Octyl-Tetraoxyethylene)、LDAO(N,N-Dimethyldodecylamine-N-Oxide)、OG(n-Octyl-β-D-Glucopyranoside)、MNG(Maltose-Neopentyl Glycol)经凝胶过滤层析置换高浓度的DDM。取均一性较好的蛋白峰浓缩至约10 mg/mL后,使用 Mem Gold MD1-39 Box 2、MemGold Box 1、Memsys MD 1-25、Memstart MD 1-21、Memplus MD1-44膜蛋白晶体筛选试剂盒进行初筛,每种去垢剂分别筛选了 240种结晶条件。最终在0.02%DDM条件下初步得到了一些形状不规则的膜蛋白晶体,更多结晶条件筛选和晶体优化正在进行中。