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背景:胰腺癌是一种侵袭性的恶性肿瘤,传统的放疗和化疗常常难以奏效,因此开发新的治疗策略(比如免疫治疗)就显得十分重要。Processed death-1(PD-1)/Programmed death-ligand 1(PD-L1)信号通路是细胞程序性死亡信号通路,一般情况下PD-1/PD-L1信号通路可以诱导和维持外周组织的免疫耐受从而在防止组织的过度炎症反应以及在自身免疫性疾病中发挥着重要的作用,而肿瘤则利用PD-1/PD-L1信号通路来抑制机体免疫,而我们发现miR142-5p可以调节肿瘤细胞PD-L1的表达从而阻断此免疫抑制信号通路,增强免疫功能从而达到杀伤肿瘤的目的。研究目标:研究miR-142-5p对PD-L1的调节作用及对抗肿瘤免疫的影响。研究方法与内容:首先我们通过先通过生物信息学手段,在Targetscan数据库及PicTar数据库中进行mi R-142-5p靶基因的预测,发现在这两个数据库中PD-L1均为miR-142-5p的靶基因;我们从TCGA数据库中的胰腺癌数据库查找数据并进行基因PD-L1的表达情况与miR-142-5p表达情况的相关性分析,得出miR-142-5p的表达与PD-L1基因的表达呈负相关且有统计学意义。而后我们进行了进一步的验证,首先用miR-NC mimics和miR-142-5p mimics分别转染Panc02细胞,Panc02细胞为小鼠胰腺癌细胞,通过荧光素酶报告实验、RT-PCR及Western Blot验证PD-L1为miR-142-5p下游靶基因。而后又通过用miR-142-5p高表达慢病毒及对照慢病毒转染Panc02小鼠胰腺癌细胞系,经筛选获得稳转细胞株,而后通过荧光素酶报告实验、RT-PCR及Western Blot验证PD-L1为miR-142-5p下游靶基因。miR-142-5p确实能起到调节PD-L1表达的作用。在体内试验中,首先构建稳转miR-142-5p高表达Panc02细胞系及对照空白细胞系,然后将小鼠胰腺癌细胞系Panc02种植到C57BL/6小鼠,以构建小鼠胰腺癌模型,而后观察肿瘤的生长变化并且分离肿瘤中的单个核细胞做流式进行免疫分析,并且提取肿瘤RNA进行RT-PCR来分析测肿瘤免疫环境的变化;在小鼠尾静脉分别注射稳转miR-142-5p高表达Panc02细胞系及对照空白细胞系,观察肿瘤转移的变化。并且进行细胞增殖实验,细胞迁移实验等来观察是否是miR-142-5p直接有促增殖或者促迁移的做干扰实验结果。结果:1)在人和鼠的Targetscan数据库及PicTar数据库中,PD-L1均为miR-142-5p的预测靶点,且人和鼠的miR-142-5p成熟序列完全相同。TCGA数据库中miR-142-5p的表达与PD-L1的表达呈负相关。2)在Panc02细胞系中,miR-142-5p高表达使得PD-L1 Wild Type(WT)3’UTR组的荧光素酶的活性明显降低,而在PD-L1 Mutant Type(MT)3’UTR组中mi R-142-5p高表达与对照相比的荧光素酶活性并没有明显变化。miR-142-5p高表达使得PD-L1的mRNA及蛋白质表达均明显降低。3)将稳转miR-142-5p及miR-NC(vector control)高表达的Panc02细胞系进行小鼠皮下荷瘤,发现miR-142-5p高表达使得肿瘤体积,重量均明显变小;在转移模型中,我们发现miR-142-5p高表达降低了肿瘤在肺中的转移。增殖实验中miR-142-5p高表达组与对照组Panc02细胞相比增殖没有显著差异,另外在迁移实验中,发现miR-142-5p高表达组相比对照组Panc02细胞迁移明显降低。4)提取小鼠肿瘤内的单个核细胞,并且进行流式抗体染色及流式细胞仪分析,发现miR-142-5p高表达后增加了肿瘤浸润T淋巴细胞,包含CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞,同时降低了PD-1+的T淋巴细胞。miR-142-5p高表达相比对照组肿瘤内浸润的Treg,巨噬细胞与DC细胞并无显著变化。miR-142-5p高表达后提高了IFN-γ和TNF-α的表达,降低了IL-10的表达。结论:1、miR-142-5p能够通过靶向PD-L1来降低PD-L1的表达。我们首先用miR-NC mimics和miR-142-5p mimics分别转染Panc02细胞,Panc02细胞为小鼠胰腺癌细胞,通过荧光素酶报告实验、RT-PCR及Western blot验证PD-L1为miR-142-5p下游靶基因,miR-142-5p能够抑制PD-L1基因的表达。而后我们构建miR-142-5p高表达及对照的稳定Panc02细胞株,而后通过荧光素酶报告实验、RT-PCR及Western Blot验证PD-L1为miR-142-5p下游靶基因,miR-142-5p能够抑制PD-L1基因的表达。2、miR-142-5p具有抑制肿瘤生长和抑制肿瘤转移的作用首先我们通过将miR-142-5p高表达Panc02细胞株及对照Panc02细胞株进行小鼠荷瘤,观察记录肿瘤的生长情况,并且进行统计学分析,发现miR-142-5p能够明显的抑制胰腺癌的生长。通过小鼠尾静脉注射miR-142-5p高表达Panc02细胞株及对照Panc02细胞株,发现miR-142-5p能够抑制肿瘤转移。3、miR-142-5p高表达抑制了肿瘤细胞的迁移,但对肿瘤细胞的增殖无明显影响通过两个细胞增殖实验,发现miR-142-5p并没有明显影响Panc02细胞的增殖。通过transwell细胞迁移实验,我们发现miR-142-5p高表达抑制了肿瘤细胞的迁移。4、miR-142-5p可通过增强抗肿瘤免疫而发挥肿瘤抑制作用miR-142-5p高表达后增加了肿瘤浸润T淋巴细胞,包含CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞,同时降低了PD-1+的T淋巴细胞。miR-142-5p高表达后肿瘤内浸润的Treg、巨噬细胞和DC细胞并无显著变化。miR-142-5p高表达后提高了IFN-γ和TNF-α的表达,降低了IL-10的表达。miR-142-5p可通过增强抗肿瘤免疫而发挥肿瘤抑制作用。