奶牛泌乳启动过程乳腺组织基因和蛋白表达研究

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奶牛泌乳发动包括两个阶段。第Ⅰ阶段开始于产前数周,特征为乳腺组织分化并逐步出现分泌活动;第Ⅱ阶段自分娩至产后数天,特征为腺泡细胞紧密连接关闭并开始分泌初乳和乳汁。为研究泌乳发动分子过程,首先用数字基因表达谱技术在转录水平上分析并比较了产前35天(-35d)、产前7天(-7d)和产后3天(+3d)乳腺组织基因表达情况。建立的三个乳腺组织cDNA库(-35d、-7d和+3d),分别包含6.2、5.8和6.1百万个21-nt cDNA标签,经与参考基因标签比对,三个cDNA库分别含有8662、8363和8359个基因。以|log2Ratio|≥1,FDR≤0.001为标准,比较三个时间点乳腺组织基因差异表达情况。-7d与-35d乳腺组织比较(Ⅰ阶段),共有812个基因差异表达,占到-7d乳腺组织cDNA库基因总数的9.7%。其中表达上调基因234个,表达下调基因578个,分别占到差异表达基因总数的28.8%和71.2%。表达上调基因主要参与细胞周期,有丝分裂,以及固醇、脂类代谢等过程,表达下调基因主要是参与免疫反应,生物粘附等过程。+3d与-7d乳腺组织比较(Ⅱ阶段),共有1189个基因差异表达,占到+3d乳腺组织cDNA库表达基因总数的14.2%。其中表达上调基因274个,表达下调基因915个,分别占到差异表达基因总数的23.0%和77.0%。表达上调基因主要是参与免疫反应等过程,表达下调基因主要是参与细胞周期等过程。泌乳启动两个阶段连续上调表达的基因11个,主要是乳蛋白基因,连续下调表达的基因17个。在第Ⅰ阶段上调、第Ⅱ阶段下调的基因共111个,它们主要是参与细胞周期等过程;在第Ⅰ阶段下调、第Ⅱ阶段上调的基因92个,主要是参与免疫反应等过程的基因。为了验证DGE结果的准确性,随机选取了13个基因,用荧光定量PCR方法测定了它们在泌乳启动过程的表达情况,发现结果与DGE结果一致。在转录水平的研究结果表明泌乳发动是通过增强细胞增殖,合成代谢,以及抑制免疫反应,细胞外基质基因表达实现的。其次用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)分析了泌乳启动两个阶段的蛋白表达情况。共鉴定出2271种蛋白,其中80%蛋白质的相对分子质量在100kDa以内。按照蛋白差异倍数>1.2倍,P值<0.05的判断标准,产前7天与产前35天相比(泌乳启动Ⅰ阶段),差异表达蛋白共373个,其中包括多种乳蛋白和免疫球蛋白,并且糖酵解相关酶蛋白表达降低,三羧酸循环相关酶蛋白表达升高。这些差异表达蛋白参与的生物学过程主要包括生物合成,细胞组分合成,和核苷酸代谢过程等。产后3天与产前7天相比,共有273个差异表达蛋白,它们参与的生物学过程主要是调控各种生物学过程,如调控生物合成过程和代谢过程。将蛋白组与转录组进行关联分析。产前7天与产前35天相比,差异蛋白和差异基因的关联系数r为0.6983,大于0,即正相关,转录水平越高,蛋白表达也越多。还有329个基因只在蛋白水平差异表达,转录水平没有差异,GO分析结果表明这些基因参与的生物学过程主要包括翻译,葡萄糖代谢,和电子传递链等。产后3天与产前7天相比,差异蛋白和差异基因的关联系数r为0.5509,大于0,也为正相关。只在蛋白水平差异表达,转录水平没有差异的基因共223个,GO分析发现这类基因参与的生物学过程主要包括翻译和免疫反应等。总之,奶牛泌乳启动I阶段,即产前7天与产前35天相比,乳腺细胞增殖,部分乳蛋白和免疫球蛋白表达上调,柠檬酸循环相关酶蛋白表达上调,细胞外基质减少,免疫相关基因表达下调,糖酵解相关酶蛋白表达下调。产后3天与产前7天相比,免疫相关基因表达上调,部分乳蛋白表达上调,细胞周期相关基因表达下调。蛋白组和转录组的关联分析表明,差异蛋白和差异基因呈正相关。而参与翻译过程,葡萄糖代谢和电子传递等过程的基因只在蛋白水平差异表达,在转录水平没有差异,这说明这类基因可能存在转录后调控机制或翻译后调控机制。
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