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老黄酶(OYE)家族的烯醇还原酶能够催化(E/Z)-柠檬醛不对称还原为(R)-香茅醛。(R)-香茅醛可以用来合成治疗乳腺癌的药物和合成天然维生素E,同时(R)-香茅醛也是合成L-薄荷醇的重要中间体。(R)-香茅醛的合成方法包括化学法和生物酶法。在生物酶法中,烯醇还原酶是不对称还原柠檬醛合成(R)-香茅醛的关键酶,该酶可以催化顺式和反式异构体的混合物进行加氢反应,所得产物的立体选择性通常是互补的,因此产物e.e.值会很低。老黄酶的对映选择性不足和活性低,限制了它的应用,所以为了使烯醇还原酶在不对称还原反应中具有较高的立体选择性,本文基于源自Saccharomyces cerevisiae CICC1060的烯醇还原酶OYE2y作了如下工作:(1)OYE2y催化的不对称还原体系的建立及最优反应体系的探索;(2)基于理性设计和定向进化对OYE2y进行改造使其具有较高的立体选择性;(3)对正向突变体建立单点饱和突变文库和多点组合突变体库。为了考察反应过程中底物与产物在不同时间段的变化,OYE2y分别以(E)-柠檬醛、(Z)-柠檬醛和(E/Z)-柠檬醛为底物开展不对称还原反应。在(E/Z)-柠檬醛不对称氢化反应的前3 h,(E)-柠檬醛的浓度下降明显快于(Z)-柠檬醛,同时,(R)-香茅醛的浓度迅速增加,e.e.值保持在大于60%(R)的较高水平。然后,(Z)-柠檬醛的反应速率在3 h到5 h之间得到了提升,导致e.e.值从65.02%(R)降低到40.26%(R)。反应6 h后,(Z)-柠檬醛的反应速率与(E)-柠檬醛接近,同时(R)-香茅醛的e.e.值几乎保持不变;11 h反应完成,反应的转化率为89.51%,(R)-香茅醛的e.e.值为38.13%(R)。当使用新鲜制备的(E)-柠檬醛或(Z)-柠檬醛反应4 h后,OYE2y的对映选择性保持在相对恒定的水平;反应到11 h后,(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛反应的e.e.值分别为82.87%(R)和32.66%(S)。烯醇还原酶OYE2y通过理性设计和分子改造来提高酶分子的立体选择性。经同源建模、结构分析和分子对接,对催化反应中心附近的氨基酸残基和待突变位点进行预测。在建立的突变体库中我们筛选到了能使立体选择性提高的突变体P76C和R330H。OYE2y的单点突变结果显示R330和P76位点可以作为OYE2y的对映选择性转换的开关。对76位点和330位点完成了单点饱和突变,分别得到了5个和17个能提高(R)对映体选择性的正向突变体。突变体R330H和P76C分别将(Z)-柠檬醛的对映选择性从32.66%e.e.(S)逆转至71.92%e.e.(R)和37.50%e.e.(R)。值得注意的是,组合突变体R330H/P76M、P76G/R330H和P76S/R330H在(E)-柠檬醛和(E/Z)-柠檬醛的还原中进一步提高了(R)-香茅醛的对映选择性(>99%)。我们的研究结果表明,对远离活性位点的氨基酸残基(例如OYE2y中的R330)进行改造,其结果也是可以改变酶立体选择性的。此外通过使用AutoDock软件进行分子对接,用(E)-柠檬醛和(Z)-柠檬醛分别与OYE2y及其突变完成对接实验,选取最佳构型进行分析。从(Z)-柠檬醛与OYE2y、P76C、R330H和P76M/R330H的对接结果来看,底物分子在突变酶的活性中心的结合模式与野生型相比都发生了一定的“翻转”,导致β位不饱和碳的加氢面发生了变化,从而使产物的构型也发生了变化,这与我们的实验结果是保持一致的。在底物与失活突变体的对接模型中,我们发现底物分子的羰基氧与失活突变体的Asn195侧链不能产生氢键,导致底物分子无法固定在活性口袋里,因此催化反应就不能发生。