大豆（Glycine max）是我国重要的油料和经济作物,是人类重要的植物蛋白和油分的来源,在食品工业和农业生产中有着重要地位。大豆作为豆科作物,可通过结瘤进行生物固氮。高效利用共生固氮对农业的可持续发展至关重要,有助于提高大豆的生产力和竞争优势。但大豆自身古四倍体基因组的冗余性,使得大豆结瘤固氮调控基因的挖掘工作相对滞后。本研究通过同源性和表达谱的分析,筛选到18个可能参与大豆结瘤调控途径的基因,借助高通量CRISPR/Cas9基因编辑技术对基因进行定点敲除。共设计20个sg RNA靶向18个目的基因,经过4次大豆的稳定转化得到覆盖所有20个sg RNA载体在内的120棵阳性转基因植株。T₀代以sg RNA统计群体的编辑效率,其平均编辑效率为32.7%。以目的基因统计整体基因编辑效率为45.8%。20个株系中,T₁代有8个株系发生基因编辑,而在T₀代仅有6个株系。T₁代基因编辑效率在T₀代基础上有所提高。从构建的“高效结瘤”突变体库中我们筛选到与结瘤自调控途径相关的“高效结瘤”突变体gmric1/ric2和营养生长缺陷的突变体gmrdn1-1/rdn1-2/rdn1-3。突变体gmric1/ric2的结瘤数量较野生型植株增长约一倍,其中gmric1/ric2^+1/-5突变体叶绿素含量较高,且叶片较野生型植株更绿,表现出更强固氮能力的可能性。突变体gmrdn1-1/rdn1-2/rdn1-3根瘤数量较野生型相比显著减少,且有营养生长缺陷的表型,说明Gm RDN是大豆正常生长和结瘤所必需的。综上,本文研究验证了高通量CRISPR/Cas9基因编辑技术在大豆基因功能筛选和分子育种中的可行性,还通过构建“高效结瘤”突变群体为研究大豆AON途径调节机制和分子设计育种提供了宝贵的遗传材料。