目的:探索GLP-1/GIP双受体激动剂DA4-JC对10月龄APP/PS1/tau阿尔茨海默病（3xTg-AD）小鼠认知和情绪行为及其病理特征的影响,并进一步研究了DA4-JC发挥神经保护作用可能的信号转导机制。方法:选用9个月大的3xTg-AD小鼠和C57小鼠,将它们随机划分为4组,分别为正常对照组（WT+PBS）、正常治疗组（WT+DA4-JC）、AD对照组（3xTg-AD+PBS）和AD治疗组（3xTg-AD+DA4-JC）。采用腹腔注射方式,根据小鼠体重每天给予一次DA4-JC（10 nmol/kg）或者等体积的PBS,给药前一天及给药期间每7天称一次体重和血糖水平,直至给药结束。连续给药30天后开始行为学实验,并在行为学期间持续给药。1.行为学实验（1）旷场试验:实验者手拿小鼠尾巴轻放于旷场的中央区域,在安静状态下让其活动5 min,记录小鼠旷场内活动的总距离和小鼠在箱体中央的活动时间百分比。（2）新物体识别实验:旷场实验结束后第二天,在旷场中放置两个完全相同的物体,然后将小鼠放入,让其自由探索10 min;5 h后将其中一个物体换为材质相同、颜色和形状不同的物体,再次让其自由探索10 min,分别记录小鼠探索新旧物体的时间[1]。检测指标为:新物体识别指数=探索新物体时间/（探索新物体时间+探索旧物体时间）×100%[2]。（3）Y迷宫自发交替实验:将小鼠由Y迷宫三臂的交汇点放入,让其自由探索8 min,记录小鼠进臂顺序以及进臂总次数,计算各组小鼠进臂的正确率以及进臂总次数[3]。（4）O迷宫实验和高架十字迷宫实验:O迷宫实验是将小鼠面对闭臂放入中央区域后自由活动10 min,记录10 min内小鼠在开放臂活动时间[4],计算各组小鼠开臂活动时间百分比。高架十字迷宫实验是将小鼠面对闭臂放入中央区域后自由活动10 min,记录10 min内小鼠的进入开臂和闭臂的次数,计算各组小鼠进入开臂与闭臂的次数百分比[5]。（5）经典Morris水迷宫实验和对位水迷宫实验:将小鼠放于水迷宫中,分别进行隐藏平台、空间探索和可视平台实验,记录各组小鼠在1 min内的逃避潜伏期,并计算比较空间探索阶段中各组小鼠在目标象限游泳的时间百分比和穿台次数[6]。经典水迷宫实验后,将平台放入对位象限中,再次进行对位隐藏平台实验和空间探索实验,指标同经典水迷宫实验,6 h之后进行可视平台实验阶段,并记录各组小鼠游泳速度和到达可视平台的时间[3]。（6）悬尾实验和强迫游泳实验:悬尾实验中,将小鼠的尾部1 cm处悬挂固定于悬尾箱中,使小鼠的鼻尖距离悬尾箱底部大约20-25 cm。将摄像头尽可能靠近小鼠,以便获得更清晰的图像,记录6 min内小鼠的不动时间,并计算各组小鼠后4 min不动时间百分比[6]。强迫游泳实验中,将小鼠放入装有15 cm深自来水的透明圆筒中,让其活动6 min,记录小鼠后4 min的不动时间,并计算各组小鼠后4 min不动时间百分比[6]。（7）恐惧惊跳箱实验:分为强化训练和检测阶段。在训练阶段,给予小鼠恐惧训练;间隔24 h后进行条件恐惧记忆的测定。电脑系统所检测的是小鼠的僵直率的变化。2.行为学实验结束后,进行电生理、分子生物学实验、形态学实验。（1）电生理LTP实验:行为学实验后,进行在体电生理记录。首先将小鼠麻醉之后固定于脑的立体定位仪上,将电极慢慢插入海马CA1区,给予适当刺激后,连续记录30 min基础场兴奋性突触后电位（f EPSP）,然后再给予高频刺激（HFS）,接着再记录60 min的f EPSP长时程增强（LTP）,评估各组小鼠突触可塑性差异。（2）Western-blotting实验:接着快速取出小鼠的新鲜海马组织,并提取蛋白,检测相关蛋白含量,制胶、上样、跑胶、转膜、封闭,然后进行一抗与二抗孵育,最后进行曝光,并用软件分析目标条带（PINK1、Parkin、p62、PSD95、SYP）的灰度值。（3）冰冻和石蜡免疫组化实验:行为学实验和电生理实验结束后,将各组小鼠脑从矢状线切开,一半用于冰冻免疫组化,一半用于石蜡免疫组化。用显微镜观察各组小鼠海马CA1区Aβ、p-tau蛋白的分布与变化。（4）高尔基染色实验:行为学和电生理实验做完后,取小鼠脑组织进行Golgi染色。该实验是使用FD Rapid Golgi Stain kit（FD Neuro Technologies）,取小鼠脑组织参照该试剂盒的说明书做完相应的步骤之后,用显微镜观察后进行拍照,并用软件统计各组小鼠树突棘的数目变化。（5）透射电镜实验:行为学和电生理实验做完后,取小鼠的海马组织并分离出CA1区,送至电镜室进行一系列相关实验处理之后,观察拍照,并统计各组小鼠海马组织中线粒体和突触的数目及形态变化。结果:（1）各组小鼠体重和血糖水平:注射DA4-JC之前和之后,四组小鼠体重无显著差异,血糖水平也无显著差异（P>0.05）。（2）旷场实验:5 min内各组小鼠的运动总距离及其在箱体中央位置活动的时间百分比均表现为无显著差异（P>0.05）。（3）新物体识别实验:3xTg-AD+PBS组小鼠NOI显著低于WT+PBS组小鼠（P<0.001）,DA4-JC治疗后有所增加（P<0.05）。（4）Y迷宫实验:各组小鼠的在Y迷宫中总进臂次数无明显统计学差异（P>0.05）。3xTg-AD+PBS组小鼠的8 min的自发交替正确率显著低于WT+PBS小鼠（P<0.001）,DA4-JC治疗后有所增加（P<0.01）。（5）O迷宫实验和高架十字迷宫实验:O迷宫实验中,3xTg-AD+PBS组小鼠10 min内进入开臂与闭臂的次数百分比显著低于WT+PBS组（P<0.01）,但DA4-JC治疗后并没有明显改善（P>0.05）。高架十字迷宫实验中,3xTg-AD+PBS组小鼠10min内在开放臂的时间百分比显著低于WT+PBS组（P<0.05）,且DA4-JC治疗后并没有明显改变改善（P>0.05）。（6）经典Morris水迷宫实验:小鼠寻找隐藏平台的逃避潜伏时间连续5 d下降。在隐藏平台阶段的第3、4、5天,与WT+PBS组相比,3xTg-AD+PBS组小鼠的找到平台的时间明显较长（P<0.05）;DA4-JC治疗后,在第4、5天的潜伏期缩短,且具有统计学意义（P<0.05）;在探索试验中,与WT+PBS组相比,3xTg-AD+PBS转基因小鼠在目标象限游泳时间占游泳总时间的百分比和穿台次数均较低（P<0.05）;DA4-JC治疗后二项指标均有所逆转（P<0.05）。对位水迷宫实验:在第7-10天的隐藏平台试验中,寻找水下隐藏平台的潜伏期连续下降;在游泳的第9、10天,可见3xTg-AD+PBS组小鼠的找到平台的时间明显长于WT组（P<0.05）;DA4-JC干预后,可见3xTg-AD小鼠在第9、10天的潜伏期显著缩短（P<0.05）;对位探索试验中,3xTg-AD+PBS小鼠在目标象限游泳时间占比和穿台次数显著低于WT小鼠（P<0.05）;DA4-JC处理后两项指标均有所改善（P<0.05）。可视平台试验:小鼠寻找到平台的时间以及在水中的游泳速度均无统计学差别（P>0.05）。（7）悬尾实验和强迫游泳实验:在悬尾实验中,3xTg-AD小鼠不动时间百分比较WT组小鼠明显增加（P<0.01）;给予DA4-JC后,3xTg-AD小鼠不动时间百分比没有显著变化（P>0.05）。在强迫游泳实验中,3xTg-AD小鼠不动时间百分比较WT组小鼠明显增加（P<0.001）;给予DA4-JC后,3xTg-AD小鼠也无显著改善（P>0.05）。（8）条件性恐惧实验:在训练阶段,WT小鼠与3xTg-AD小鼠僵直比率随着训练时长均逐渐增加,但四组小鼠之间的僵直比率没有表现出显著差异（P>0.05）。但在恐惧记忆检测阶段中,与WT+PBS组相比,3xTg-AD+PBS组小鼠条件刺激下的僵直比率较WT组的显著降低（P<0.001）;DA4-JC治疗后,3xTg-AD小鼠条件刺激作用下的僵直比率显著增加（P<0.01）。（9）在体海马LTP:各组小鼠的I/O曲线无显著差异,且在同一适宜刺激强度下各组间f EPSPs幅度均没有显著性差异（P>0.05）。四组小鼠PPF（f EPSP2/f EPSP1）比值也没有表现出显著差别（P>0.05）。各组小鼠在HFS之后,LTP均显示诱导成功,HFS刺激后30 min和60 min,与WT+PBS组相比较,3xTg-AD+PBS组小鼠海马CA1区f EPSP斜率变化百分比显著下降（P<0.05）,DA4-JC治疗后均有所逆转（P<0.05）。（10）Western-blotting实验:3xTg-AD+PBS组小鼠海马组织内PINK1、Parkin、PSD95、SYP的平均灰度值均明显低于WT+PBS组（P<0.001）,P62平均灰度值显著高于WT+PBS组（P<0.001）;与3xTg-AD+PBS组相比较,3xTg-AD+DA4-JC组小鼠海马组织中PINK1、Parkin、PSD95、SYP的平均灰度值显著升高（P<0.05）,同时P62平均灰度值著降低（P<0.001）。（11）冰冻/石蜡免疫组化实验:与WT+PBS组相比,Aβ和p-tau所占面积百分比在3xTg-AD+PBS组中显著增加（P<0.001）,而DA4-JC治疗后3xTg-AD小鼠Aβ和p-tau所占面积百分比明显下降（P<0.001）。（12）高尔基染色实验:统计分析镜下每μm树突棘数目和形态发现,3xTg-AD+PBS组小鼠树突棘数目低于WT+PBS小鼠（P<0.001）;与3xTg-AD+PBS组相比,3xTg-AD+DA4-JC组小鼠的树突棘数目明显增加（P<0.001）。（13）透射电镜实验:观察统计电镜下线粒体数目和形态发现,3xTg-AD+PBS组小而圆的线粒体数量明显多于WT+PBS组（P<0.001）,且线粒体多表现为嵴断裂,线粒体肿胀;DA4-JC治疗后,可见电镜下3xTg-AD+DA4-JC组小而圆的线粒体数目明显减少（P<0.001）,线粒体形态相对完好。同时观察统计电镜下突触数目和突触形态发现,3xTg-AD+PBS组小鼠突触数量明显少于WT+PBS组,突触形态异常。与3xTg-AD+PBS组相比,3xTg-AD+DA4-JC组小鼠的突触数目和突触结构有所改善（P<0.001）。结论:（1）DA4-JC部分逆转了3xTg-AD小鼠的探索能力、空间工作记忆能力、长期的学习记忆认知能力及认知灵活性、恐惧记忆能力,但并不能改善其焦虑和抑郁情绪。（2）DA4-JC可保护3xTg-AD小鼠脑内海马突触的可塑性;DA4-JC可增加海马神经元树突棘的数量。DA4-JC可以增加3xTg-AD小鼠电镜下海马CA1区的突触数量,且使突触大小结构趋向于正常化。DA4-JC可以提高3xTg-AD小鼠海马PSD95和SYP蛋白水平。（3）DA4-JC减少了3xTg-AD小鼠脑内Aβ和p-tau蛋白的沉积。（4）DA4-JC可升高3xTg-AD小鼠海马组织中的PINK1、Parkin的水平,同时降低P62水平,改善了受损的线粒体自噬途径。（5）DA4-JC可使正常线粒体数量增加,改善线粒体形态和结构损伤。综合以上结果可以得出,GLP-1/GIP/双受体激动剂DA4-JC所表现的改善3xTg-AD小鼠学习记忆认知行为障碍,Aβ和p-tau病理特征、突触、树突棘结构及功能损伤可能与其上调海马内PINK1、Parkin的水平,降低P62水平,以提高自噬和线粒体自噬有关。由此提示,GLP-1/GIP双受体激动剂DA4-JC可能对防治阿尔茨海默病疾病进展具有一定的积极意义。