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基因打靶技术是研究酵母分子生物学的重要工具，是研究特定基因功能或胞内蛋白相互作用的重要手段之一，模式酵母，如酿酒酵母或裂殖酵母，已经建立了较为有效的基因打靶系统。然而与模式酵母相比，巴斯德毕赤酵母的基因打靶效率低下，大大限制了其在基础研究和工业上的应用。 鉴于巴斯德毕赤酵母近十年在蛋白表达和化学品生产上日益广泛的应用，本研究拟从分子水平改造毕赤酵母菌株，提高其基因打靶效率，以满足其在基因工程和代谢工程中改造的需求。 为达到上述研究目的，主要采取以下两个策略进行改造:1）通过提高靶细胞适应性来加强基因打靶效率。以参与巴斯德毕赤酵母GS115糖基化途径的OCH1基因敲除为例，首先通过一个辅助载体在GS115细胞中备份表达OCH1基因，再对含有辅助载体的GS115进行基因组上OCH1基因的敲除。OCH1基因作为毕赤酵母糖基化途径的重要基因，其功能的缺失对细胞的生长造成很大影响，而通过辅助载体表达造成的OCH1基因冗余大大弥补了基因组上OCH1基因缺失菌株的生长缺陷。在使用相同同源臂长度的情况下，与传统一步法敲除相比，巴斯德毕赤酵母GS115基因组上OCH1基因的敲除阳性率提高了两个数量级。同时，用相同的策略又对巴斯德毕赤酵母GS115基因组上KU70和SGS1基因进行了敲除，发现基因置换效率都得到显著提高，其中，KU70基因的敲除率提高到2倍，SGS1基因的敲除率提高了23倍。该研究为非传统酵母提供了顽固基因敲除的有效策略，且表明基因敲除导致的功能缺失以及进一步引起的细胞适应性下降是导致单倍体非传统酵母基因打靶效率低下的重要因素。2）通过特定DNA复制相关基因的修饰来提高基因打靶效率。基于同源重组的基因打靶效率取决于DNA双链缺口修复的两个竞争途径:同源重组(HR)和非同源重组(NHEJ)。通过对起始NHEJ途径的KU70基因与调节HR途径的SRS2和SGS1基因的敲除，得到这三个基因的敲除突变株，分别进行ARG1基因敲除并计算敲除阳性率，从而评价SRS2，KU70和SGS1敲除对同源重组基因置换效率的影响。研究发现，除SRS2基因外，KU70和SGS1基因的敲除都显著提高了同源重组基因置换效率，与母菌GS115相比，SGS1突变株的基因敲除率提高到2倍，而KU70突变株使得原来不到5％的ARG1基因敲除率提高到了95％以上。