中介体（Mediator complex）是真核生物各种转录因子与RNA聚合酶Ⅱ之间的联接桥梁;负责整合细胞内所有转录调控信号,通过促进或者阻止转录起始前复合物的组装和稳定,精准地调节基因表达。中介体包括几十种不同的亚基,在结构和功能上分为头部、中部、尾部和可动态结合的CDK8模决;其模块化结构和亚基组成从低等的酵母到高等的哺乳动物高度保守。中介体在生物体内的表达丰度低、组成上的多样性、以及结构上的不均一性等特性严重阻碍了中介体结构和功能研究,因此目前对中介体结构和功能的认识十分有限。冷冻电镜（cryo-EM）是一种新型的结构生物学的技术和方法,可以捕捉生物大分子在接近生理条件下的不同构象的结构信息,进行生物学功能的动态研究。近年来,酿酒酵母、裂殖酵母、和人源的中介体的三维电镜结构相继报道,但受限于结构上的复杂性,已报道的电镜结构分辨率很低,无法定位各个模块,对于中介体的模块化结构认识仍旧非常模糊。首先,我们系统优化了酿酒酵母中介体的纯化条件,获得了纯度、浓度和均一度都显著提高的样品;在此基础上,从计算上区分了不同的构象状态,分别进行三维重构;获得了首个不同构象状态中介体的精细三维结构;揭示了中介体的结构柔性主要来自其底部模块的旋转。为了提高中介体三维结构的分辨率,我们应用酵母遗传学的方法“庖丁解牛”将完整中介体肢解成各个模块和模块的组合,分别进行结构和功能的研究。我们成功纯化了高纯度和均一度的中介体核心复合体-“头部+中部+尾部”模块（21个亚基,～1 MD）,以及中介体功能核心-“头部+中部”模块（16个亚基,559kDa）、中介体的头部模块（7个亚基,223 kDa）以及可解离的CDK8激酶模块（4个亚基,427 kDa）。其次,我们解析了内源性纯化的中介体“头部”模块,“头部+中部”模块,以及“头部+中部+尾部”模块的三维电镜结构,通过细致比较中介体及其各个功能模块组合的精细三维结构,首次清晰划分了各个功能模块的边界;并成功地运用纳米金颗粒标记的方法,明确定位了各个功能模块在中介体整体结构中的位置,重新定义了中介体的模块化的组织架构。再次,通过收集大量的电镜数据,在计算上区分“头部+中部”模块不同的构象和组成状态,分别进行三维重构;我们重构了各种组成和构象状态的精细三维结构;发现头部模块是中介体“头部+中部”模块乃至整个中介体组装的骨架、中部模块的柔性最为显著;阐明了头部模块与中部模块相互作用的分子细节（Med14亚基主要介导了头部和中部模块的多重相互作用）;此外,我们重构了中介体头部模块多种不同构象状态的电镜结构,可以直接检测到晶体结构中所缺少的20%的结构信息,系统研究了头部模块的结构柔性。最后,我们进一步克服了中介体可解离的CDK8模块容易降解、不易纯化、结构动态的困难,成功纯化了CDK8模块,并解析了其三维结构,阐明了其结构柔性和四个亚基相互作用方式;发现Med13亚基是CDK8模块中最为柔性的亚基;CDK8模块结合中介体也伴随着转录的激活;能够诱导中介体采取较为伸展的构象,这种构象通常认为是处于转录激活状态的中介体。综上所述,我们系统了研究中介体的模块化结构,重新定义了中介体的模块化的组织架构、阐明了中介体重要模块的相互作用;对于推进中介体结构和功能的认识,揭示中介体调控真核生物基因表达及其调控的分子机制具有较大意义。