遗传性非息肉病性结直肠癌(Hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)是一种常染色体显性遗传性恶性肿瘤综合征,外显率高达80%-90%,占所有结直肠癌的2%-15%。HNPCC与散发性结直肠癌(Sporadic colorectalcancer,SCRC)相比,无论在发病机制、临床特征、治疗方案的选择和随访方案的制定上均不尽相同。为此,区分HNPCC与SCRC不仅具有重要的临床意义,而且有利于HNPCC家系成员的遗传学咨询。目前,世界许多国家和地区都制定了一定的HNPCC临床诊断标准,如Amsterdam标准、Amsterdam修改标准、日本标准及Bethesda指导纲要等。然而,要确诊HNPCC家系和HNPCC患者仅仅依靠上述临床诊断标准显然是不够的,HNPCC的确诊依赖于错配修复(Mismatchrepair,MMR)基因胚系病理性突变的检出。目前,国内仅有小家系hMSH2和hMLH1基因胚系突变的研究及少数临床病例报道,没有进行较大HNPCC家系的分子遗传学筛检,可能会遗漏很大一部分HNPCC的确诊。本研究组先前进行了50余个符合不同临床标准的HNPCC家系胚系hMSH2和hMLH1基因突变方面的研究,发现国人HNPCC患者hMSH2和hMLH1基因的胚系突变率约为31%,明显低于文献报道的80%-90%。是否有其它MMR基因的突变或MMR基因的其它异常形式导致了HNPCC的发生?目前国内尚未见这方面的研究报道。为此,对HNPCC家系深入开展hMSH6基因胚系突变检测,hMSH2、hMLH1、hMSH6和hPMS2基因大片段缺失检测及hMLH1基因胚系启动子甲基化研究,对于HNPCC家系全面的分子遗传学筛选,防止遗漏部分HNPCC家系的诊断具有重要意义。故本研究对上述几个部分分别报告如下:第一部分中国人HNPCC家系先证者hMSH6基因胚系突变的测序研究目的:1.分析无hMSH2和hMLH1基因胚系突变的中国人HNPCC患者hMSH6基因胚系突变情况;2.评价hMSH6基因胚系突变检测在HNPCC家系分子遗传学筛选中的作用。方法:收集经过hMSH2和hMLH1基因胚系突变检测无hMSH2和hMLH1突变的HNPCC家系39个,其中符合Amsterdam标准的家系11个、符合日本标准的家系11个及17个符合Bethesda指导纲要的家系,分别收集各HNPCC先证者外周血样本,提取胚系基因组DNA;利用PCR技术分别扩增hMSH6基因的10外显子(计18个片段);PCR产物纯化后进行DNA测序;对测序结果进行生物信息学分析;对检测到的错义突变采用137个正常人基因组DNA进行PCR扩增和测序来排除是否为单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP);对检测到的hMSH6基因的所有SNP进行分析。结果:在39个符合不同临床标准且无hMSH2和hMLH1基因胚系突变的HNPCC先证者中,共检测到6个hMSH6基因的胚系突变。其中H14患者的hMSH6基因第6外显子c.3488A＞T的错义突变在健康人群中的发生率约3.6%(5/137),为未报道过的新发现的SNP。其余5个是尚未报道的新突变,其中1个为位于第4外显子密码子493处c.1477G＞T的无义突变、1个为位于第9内含子的插入突变即c.4001-9InsTTTT,可能导致第十外显子的剪接异常、3个为错义突变分别为第4外显子c.1403G＞A、第4外显子c.1996T＞C及第9外显子c.3851C＞T,其中c.1403G＞A的突变发生在符合Amsterdam标准的H3患者。hMSH6基因胚系突变率约为12.8%(5/39)。hMSH6基因的SNP主要分布在第1外显子c.116 G＞A、第3外显子c.458-52 T＞G及第5外显子c.3306 T＞A,分别占33.7%(31/92)、18.5%(17/92)、31.5%(29/92),该3个位点及形式的SNP可能是HNPCC家系hMSH6基因SNP发生热点。结论:1.在无hMSH2和hMLH1基因胚系突变的HNPCC先证者中,hMSH6基因的胚系突变率较低约为12.8%,但对该部分家系进行hMSH6基因胚系突变的检测可能是必要的,有利于防止部分HNPCC家系的漏诊。2.hMSH6基因的胚系突变可以发生在具有典型HNPCC临床特征的Amsterdam标准的患者。3.hMSH6基因第1外显子c.116 G＞A、第3外显子c.458-52 T＞G及第5外显子c.3306 T＞A,这三个位点的SNP可能是HNPCC患者hMSH6基因SNP发生热点,对于hMSH6基因的SNP研究具有重要意义。4.hMSH6基因第6外显子c.3488A＞T的错义突变是新发现的国际上未报道的新的SNP。第二部分遗传性非息肉病性结直肠癌hMSH6蛋白表达的研究目的:1.评价第一部分检测到的6个hMSH6基因胚系新突变的功能。2.评价hMSH6基因蛋白表达异常的MMR缺陷表型与另一种MMR缺陷表型MSI之间的关系。方法:收集符合不同临床诊断标准的50个HNPCC家系(含检测到hMSH6基因胚系突变的6个家系)先证者的肿瘤组织,采用Envision二步法检测各患者肿瘤组织hMSH6蛋白的表达;收集并整理上述50个HNPCC患者的先前hMSH2、hMLH1和hMSH6基因胚系突变检测结果、微卫星检测结果及6个有hMSH6基因胚系突变的HNPCC家系的临床资料。结合IHC和MSI结果综合分析6个hMSH6基因胚系突变的功能并评价hMSH6蛋白表达与MSI的关系。结果:1.50个HNPCC家系基本资料:50个HNPCC家系中,符合Amsterdam标准的家系24个(1个符合ACⅡ),13个符合日本标准,剩余13个HNPCC家系符合BG标准。其中有hMSH2基因胚系突变的7例,有hMLH1基因胚系突变的11例,有hMSH6基因胚系突变的6例。除7位HNPCC先证者肿瘤组织显示微卫星稳定(Microsatellite stability,MSS)外,其余家系的先证者肿瘤组织均为高频微卫星不稳定(High frequency microsatellite instability,MSI-H)。2.6个有hMSH6基因胚系突变家系的临床资料:6个家系中1个符合AC标准、2个符合JC标准、3个符合BG标准。共有肿瘤患者20个,平均最初发病年龄为42.8岁,有异时多原发癌者3例,其中H61患者33岁时患左半结肠癌、45岁时患子宫内膜癌和卵巢癌、51岁时患右半结肠癌。右半结肠癌4个约占36.4%(4/11),左半结肠癌7个约占63.6%(7/11)。3.IHC检测结果:50个先证者中共检测到12个hMSH6蛋白表达异常(5个为弱表达,7个为失表达),其中6个有hMSH6基因胚系突变的患者5个为hMSH6蛋白失表达、1个为阳性表达(证实该例hMSH6突变为新发现的SNP);5个hMSH6蛋白弱表达患者均为具有MSI-H表型并有hMSH2基因胚系突变;最后2个hMSH6蛋白失表达病例分别为H45和H47患者,H45患者具有MSI-H表型、hMLH1基因胚系突变并有hMSH6基因Exon1缺失(第三部分检测结果),H47患者具有MSS表型和hMLH1基因胚系突变。其余38个患者均为hMSH6蛋白阳性表达(32个具有MSI-H表型,6个具有MSS表型)。结论:1.检测到的6个hMSH6基因胚系新突变中,5个有hMSH6蛋白功能的改变,为病理性的;2.hMSH6蛋白弱表达表型可能与hMSH2基因的胚系突变有关;3.hMSH6蛋白表达缺陷可发生在具有MSS表型的HNPCC患者;4.hMSH6蛋白弱表达表型并不能预示hMSH6基因的突变,而失表达表型可能预示hMSH6基因的突变。第三部分应用MLPA-Array技术检测中国人HNPCC患者MMR基因的大片段缺失与扩增目的:1.建立一种新的、简便的快速检测HNPCC家系MMR基因的缺失和扩增等基因拷贝数变化的检测方法;2.运用MLPA-Array技术检测符合不同临床诊断标准的HNPCC患者hMSH2、hMLH1、hMSH6和hPMS2基因大片段缺失和扩增情况,全面了解MMR基因大片段缺失和扩增在HNPCC分子遗传学筛选中的作用。方法:收集80个符合不同临床诊断标准的HNPCC家系,其中符合Amsterdam标准的家系28个、符合JC标准的家系19个、符合Bethesda指导纲要的家系33个。收集各家系先证者外周血提取胚系基因组DNA。应用MLPA-Array技术检测各患者hMSH2、hMLH1、hMSH6和hPMS2基因的大片段改变情况,每个样本重复一次MLPA-Array,对MLPA-Array检测结果应用传统的MLPA技术进行验证保证结果的准确性。分析中国人HNPCC家系总体MMR基因大片段异常情况及各MMR基因的大片段异常频率。结果:在80个符合不同临床标准的HNPCC家系的先证中应用MLPA-Array技术检测平台共发现19个MMR基因大片段缺失的患者,异常率为23.75%(19/80),其中8个符合AC标准、3个符合JC标准、8个符合BG标准。检测到的19个MMR基因的大片段异常,均为大片段缺失、未见扩增现象,其中hMSH2基因的大片段缺失9个占47.4%(9/19)、hMLH1基因的大片段缺失7个占36.8%(7/19)、hMSH6基因的大片段缺失3个占15.8%(3/19)、hPMS2基因的大片段缺失0个,hMSH2和hMLH1基因的大片段缺失共16个约占84.2%(16/19)。应用传统的MLPA技术验证上述结果发现两者100%符合。结论:1.MLPA-Array技术是一种简便、快速和高通量检测MMR基因大片段异常的技术方法,可以应用于我国HNPCC的分子遗传学筛选工作;2.HNPCC患者MMR基因的大片段异常主要表现为大片段缺失;3.中国人HNPCC患者MMR基因大片段缺失发生率约为23.75%(19/80),主要分布在符合AC标准和BG标准的患者;4.HNPCC患者MMR基因的大片段缺失以hMSH2和hMLH1基因多见约占84.2%(16/19),其次为hMSH6基因的大片段缺失占15.8%(3/19),而未见hPMS2基因的大片段缺失;5.对中国人HNPCC家系进行hMSH2、hMLH1和hMSH6基因大片段缺失的检测对于HNPCC的分子遗传学筛选是必要的。第四部分中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系hMLH1基因启动子甲基化研究目的:1.检测hMLH1基因胚系启动子甲基化状态在中国人HNPCC家系患者中的发生状况:2.评价hMLH1基因胚系启动子甲基化检测在HNPCC分子遗传学筛选中的价值。方法:收集具有MMR基因缺陷表型MSI-H,且经过hMSH2、hMLH1和hMSH6基因突变检测无突变的符合不同临床诊断标准的HNPCC家系18个,同时收集无hMSH2、hMLH1和hMSH6基因胚系突变并具有MSS表型的HNPCC患者6例作比较研究。收集各家系先证者外周血提取胚系基因组DNA,设计hMLH1基因甲基化及非甲基化特异性的PCR引物,采用甲基化特异PCR(MethylationSpecific PCR,MSP)的方法分别扩增各检测样品的甲基化和非甲基化目的条带,根据两者的出现状况判定各样品的甲基化状态,同时采用克隆测序的方法验证PCR扩增结果。为了保证结果的可靠性,采用已确定有hMSH2基因胚系c.2228C＞A无义突变的HNPCC患者(H65)的基因组DNA作为hMLH1基因甲基化的阴性对照,采用国际上公认有hMLH1基甲基化的SW48结肠腺癌细胞株的DNA作为甲基化的阳性对照,以水代替DNA模板作空白对照。同时采用Envision二步法检测有hMLH1基因甲基化的患者肿瘤组织hMLH1蛋白的表达,判断甲基化状态对hMLH1蛋白表达的影响。结果:在18例无hMSH2、hMLH1和hMSH6基因胚系突变且具有MSI-H表型的HNPCC患者中有5例患者显示hMLH1基因甲基化,其中完全甲基化2例、部分甲基化3例;13例未甲基化患者中8例为符合JC标准和BG标准的HNPCC先证者、5例符合AC标准,部分甲基化患者均为符合AC标准的HNPCC先证者,而2例完全甲基化患者分别为H10和H29,其分别符合HNPCC临床诊断标准JC及AC。可见,在具有MSI-H表型而无hMSH2、hMLH1及hMSH6基因胚系突变的HNPCC患者中,符合AC标准的患者hMLH1基因甲基化异常率22.2%(4/18)明显高于JC组5.6%(1/18)。而在无hMSH2、hMLH1和hMSH6基因胚系突变并具有MSS表型的6例HNPCC患者中未发现甲基化病例,可见hMLH1基因的甲基化可能与微卫星表型有关。Envision二步法检测hMLH1蛋白表达结果显示:只有完全甲基化的两例患者肿瘤组织显示hMLH1蛋白失表达,而部分甲基化的病例肿瘤组织hMLH1蛋白表达正常,提示完全甲基化方可导致hMLH1基因的表达缺陷。结论:1.具有MSI-H表型且无hMSH2、hMLH1和hMSH6基因胚系突变的HNPCC患者hMLH1基因胚系启动子甲基化异常率约为27.8%(5/18),而完全甲基化仅占11.1%(2/18)。在所有HNPCC患者中的发生率可能更低;2.hMLH1基因甲基化与MMR基因的微卫星表型有关,具有MSI-H表型的患者易于发生hMLH1基因的甲基化;3.hMLH1基因的完全甲基化能影响hMLH1基因的表达,而部分甲基化不一定影响hMLH1基因的表达;4.hMLH1基因胚系甲基化检测可以作为HNPCC的分子遗传学筛选的一部分,但应对病例进行选择,可能不宜作为普遍筛检指标。