论文部分内容阅读
苹果（Malus domestica）是世界主要水果之一,在世界果品生产中占有重要地位。西北黄土高原是我国苹果的优生区和主产区,但该地区降水量少、土壤贫瘠和病害较多,严重影响苹果的生产效益。自噬可在植物生长发育或胁迫过程中,通过降解细胞内大分子物质,循环利用多余或受损的细胞成分,保障植物在胁迫环境下的生存。因此自噬在植物叶片衰老、营养饥饿和氧化胁迫中发挥着重要的作用。目前关于苹果自噬基因的发掘和功能研究鲜有报道。本文首次从苹果基因组中鉴定出一个自噬相关基因（AuTophaGy-related genes,ATG genes）MdATG18a,并探究了其对不同逆境的响应。通过遗传转化技术获得了转基因苹果、番茄（Solanum lycopersicum）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株,并对这些转基因植株进行了不同逆境处理,鉴定MdATG18a在不同胁迫下的功能。获得的主要结果如下:1.MdATG18a ORF全长1281bp,编码426个氨基酸。蛋白质预测表明其含有两个WD40结构域。系统发育分析表明,MdATG18a与拟南芥AtATG18a亲缘关系最近。亚细胞定位表明,MdATG18a定位于细胞核和细胞膜。从苹果基因组DNA中克隆了MdATG18a长度为1824bp的启动子,顺式作用元件分析表明启动子中含有响应非生物胁迫的关键顺式作用元件,如MBS、LTR和ARE。MdATG18a在根、叶、茎尖、茎和花中均有表达,黑暗诱导叶片衰老、干旱、高温、氧化、氮饥饿和内质网胁迫处理可明显诱导MdATG18a上调表达。因此,MdATG18a参与响应苹果叶片衰老和非生物胁迫过程,暗示自噬可以参与调控苹果植株对不同胁迫的抗性。2.过表达MdATG18a显著增强了植株的抗旱性。在干旱胁迫下,与野生型相比,转基因番茄和苹果植株的相对含水量较高、丙二醛含量和相对电导率较低;此外,转基因苹果植株的光合速率和抗氧化能力显著高于野生型,其体内的过氧化氢含量显著低于野生型,且转基因苹果植株中不溶性蛋白占总蛋白的比例较低,氧化蛋白积累量较少;转基因苹果中核心自噬相关基因转录水平也显著高于野生型。透射电镜分析表明转基因苹果植株在干旱胁迫下自噬体积累增加。上述结果表明过表达MdATG18a可促进苹果植株体内自噬体的产生,增强自噬活性,从而提高了转基因苹果植株的抗旱性,说明MdATG18a在苹果响应干旱胁迫中具有重要作用。3.过表达MdATG18a增强了转基因拟南芥和苹果植株对氮饥饿胁迫的耐受性并促进花青苷积累。类黄酮生物合成和调控基因（MdPAL、MdCHS、MdCHI、MdANS、MdUFGT和MdMYB1）的上调表达以及可溶性糖含量的升高促进了转基因苹果中花青苷的积累。过表达MdATG18a上调了淀粉酶基因（（MdAM1））和糖代谢相关基因（MdSS1、MdHXKs、MdFK1和MdNINVs）的表达并且促进了苹果植株中淀粉降解。此外,MdATG18a可通过上调硝酸还原酶MdNIA2和三种高亲和力的硝酸盐转运蛋白MdNRT2.1/2.4/2.5的表达,从而提高转基因苹果植株体内的氮含量。过表达MdATG18a也促进了其它自噬相关基因的表达和氮饥饿条件下自噬体的产生。这些结果表明,过表达MdATG18a增强了植株对氮饥饿胁迫的耐受性,并且可通过提高自噬活性在花青苷生物合成中发挥正调控作用。4.过表达MdATG18a增强了苹果植株对褐斑病菌（D.mali）的抗性。与野生型相比,接种D.mali后,转基因苹果叶片中H2O2积累较少,水杨酸（SA）含量提高。几丁质酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因和响应SA信号的相关基因在转基因苹果中的表达均高于野生型。接种D.mali同样提高了核心自噬基因的转录水平。这表明过表达MdATG18a可通过激活H2O2清除系统活性和SA的合成,增强了苹果植株对褐斑病菌的抗性。