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石油资源储量不断减少,而且石油基燃料和化学品大量使用产生的环境污染及气候变化等问题日益突出,严重影响经济和社会的可持续发展。木质纤维素类生物质资源丰富且可再生,特别是各类农林废弃物,其主要成分半纤维素和纤维素可以水解为糖,进而通过微生物发酵生产生物燃料和生物基化学品。这一生物炼制技术路线,可望替代石油依赖型经济,已经得到国内外的广泛关注。半纤维素易于水解,但纤维素作为植物细胞壁的主要成分提供保护作用,自然进化使其对水解有强抗性,特别是对酶的作用。因此,高效低成本纤维素酶成为建立基于纤维素水解的糖平台,乃至生物炼制的瓶颈之一。纤维素酶是复合酶系,主要由纤维二糖水解酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶等组成,高效降解木质纤维素类生物质需要多种酶组分的协同作用。来自丝状真菌里氏木霉的Trichoderma reesei Rut-C30是纤维素酶高产菌株之一,已广泛应用于工业生产,但纤维素酶发酵过程酶产量低导致成本高的问题特别突出,无法用于木质纤维素类生物质资源的生物炼制。T.reeseI纤维素酶合成调控机制研究表明,纤维素酶的生物合成主要由Xyr1、Crel等内源转录调控因子调控,但其他影响因素还有待进一步阐明。锌指蛋白具有锌指结构,是多种生命体系中普遍存在的转录因子,利用人工设计的锌指蛋白文库进行改造并选育突变体,调控基因转录,已广泛应用于大肠杆菌和酵母等微生物,并成功获得了耐温性等表型或外源蛋白过量表达的突变体,但是目前为止还未见其应用在丝状真菌中的报道。本研究工作首次探讨了人工锌指蛋白（Artificial Zinc Finger Protein,AZFP）对里氏木霉纤维素酶生产的影响,利用AZFP文库转化T.reesei Rut-C30,筛选高产纤维素酶的丝状真菌突变体,并与对照菌株比较,研究突变体纤维素酶组分和蛋白分泌情况。本文主要内容如下:构建了适用于丝状真菌的表达载体,比较了原生质体转化和根癌农杆菌介导转化方法,并对根癌农杆菌介导转化方法进行了条件优化,确定最佳转化条件为:根癌农杆菌AGL-1生长OD660值达到0.8时,在βH5.3、24℃及乙酰丁香酮浓度200 μM条件下进行转化共培养,转化效率可达到200个转化子/106孢子。进而,构建丝状真菌人工锌指蛋白表达载体文库并转化T.reesei Rut-C30,获得了近600个转化子,通过纤维素平板培养和摇瓶液体发酵筛选,获得了高产纤维素酶的T.reeseiRut-C30转化子（U3）。对U3进行性能验证,发现其纤维素酶活性比出发菌株提高了 55%,通过RNA定量分析和纤维素酶组分酶学性质测定,确定U3菌株的β葡萄糖苷酶活性比出发菌株提高了 8倍,同时内切葡聚糖酶活性提高了 28%。利用粗酶液对碱预处理玉米秸秆进行水解,其葡萄糖收率比出发菌株T.reesei Rut-C30粗酶液水解过程提高了 115%。这些结果表明:U3菌株纤维素酶酶系的组成在其人工锌指蛋白AZFP-U3的作用下发生了显著变化,从而提高了纤维素组分的酶解效率。对AZFP-U3潜在的靶点基因进行分析,结合实时定量PCR的验证结果,进一步选择并对四个可能的靶基因进行功能验证,分别编码两个功能未知假定的转录因子（TrireC30125610和TrireC307183）、线粒体内膜转运蛋白（TrireC30<sub>46633）和糖苷水解酶（TrireC3088814）基因。构建表达载体,将上述基因在T.reesei Rut-C30中过量表达,检测其对纤维素酶生产的影响,发现转录因子125610的过表达使Rut-C30胞外纤维素酶酶活提高了 200%,同时转化子T125610胞外蛋白分泌能力提高了 219%。通过人工锌指蛋白文库筛选得到的另外一个转化子U5比U3具有更强的纤维素降解能力,其胞外分泌的纤维素酶活性比出发菌株提高了 112%,同时检测到其胞外蛋白分泌量提高了大约86%。比较U5和出发菌株发酵获得的粗酶液对碱预处理后的玉米秸秆进行酶解效果,发现其葡萄糖收率提高了 33.9%。主要纤维素酶基因转录分析和各组分酶活测定都表明U5纤维素酶各组分酶活发生显著变化,对U5和出发菌株进行比较转录组学分析,进一步揭示人工锌指蛋白提高纤维素酶合成的分子机理。转录组学分析结果表明:培养24 h时,U5突变株糖苷水解酶、转运蛋白、转录因子及蛋白酶体,参与mRNA监测途径、内质网蛋白加工途径的基因,转录水平比出发菌株有显著提高,而且过氧化物酶体、CoA合成途径、N-糖苷合成途径、氨酰-tRNA合成途径、烟酰胺代谢途径、脂肪酸代谢途径相关基因转录水平也有上调,为纤维素酶转录和蛋白修饰加工过程中提供氨基酸前体、辅酶和能量。此外,U5中丝状真菌蛋白分泌压力响机制（RESS）受到激活,在48 h时尤为明显,RESS的激活可使过多的mRNA迅速降解,尽管RESS与纤维素酶合成的关系还有待深入研究,此时突变体U5中主要糖苷水解酶和内质网蛋白加工相关蛋白基因转录量与出发菌株相比仍然显著上调,表明AZFP-U5对糖苷水解酶转录和翻译后修饰具有促进作用。AZFP-U5潜在的靶点基因转录分析也发现变化,这些基因包括负责蛋白翻译后修饰、信号传递、氨基酸代谢的基因。比较转录组学数据分析结果,为进一步探讨人工锌指转录因子在T.reesei中的作用机制,并寻找关键调控基因进行进一步代谢工程改造奠定了基础。本研究工作利用人工锌指蛋白技术对T.reesei Rut-C30进行了代谢工程改造,证明人工转录因子可以有效用于提高其纤维素酶活性和蛋白分泌能力,为进一步选育高产纤维素酶T.reesei菌株奠定了基础,也为改造其他丝状真菌,提高蛋白表达和分泌能力提供了借鉴。