论文部分内容阅读
对硝基苯酚(PNP)是硝基酚类污染物的最重要成分,应用于多个领域,且长期残留在环境中,对人类和动物的血液、肝及中枢神经系统产生明显的毒害作用。目前为止,已有多株能够完全降解PNP的微生物被分离鉴定,不同菌属来源的微生物降解PNP的代谢途径和降解关键基因已经被广泛研究,但是参与PNP微生物降解过程的调控机制的研究尚不明晰。Pseudomonas putida DLL-E4是本实验室刘智博士分离保藏的一株高效降解PNP的菌株。通过基因组信息挖掘发现DLL-E4中有两套PNP降解基因簇pnp和pnp1。前期实验发现第二套基因簇pnp1在PNP降解过程中没有发挥作用;第一套基因簇pnp中的pnpA是PNP降解生成HQ(PNP中间代谢产物)的关键基因,pnpC1C2是HQ降解的关键基因。DLL-E4中的两个基因pnpR和pnpRI编码的蛋白属于LysR家族转录调控蛋白,PnpR对于pnpC1C2的转录具有正调控作用,PnpR和PnpR1对于pnpA的转录具有正调控作用。本研究在这些研究基础之上,利用现代生物技术研究方法阐明LysR家族调控蛋白对PNP降解关键基因的具体调控机制和降解关键基因的催化机制。为了研究PnpR和PnpR1对pnpA的调控机制,利用表达载体pMAL-c5X实现了PnpR和PnpR1在大肠杆菌BL21中的大量表达,纯化后的PnpR和PnpR1与pnpA启动子DNA进行体外结合实验,实验结果表明PnpR和PnpR1皆可以单独与pnpA启动子DNA结合,且这种结合也不依赖于诱导物的存在。以gfp作为报告基因,研究PnpR和PnpR1激活pnpA转录所需的诱导物,将pnpR和pnpR1分别与pnpA(PA)的启动子DNA融合表达,以绿色荧光蛋白GFP作为报告基因原位检测pnpA的转录,将构建好的质粒pBBR-pnpR-PA-gfp和pBBR-pnpR1-PA-gfp导入P.putida KT2440中,利用荧光强度来检测转录是否激活,从而确定诱导物。通过Western blot来研究诱导物之间的相互作用。实验结果表明PnpR激活pnpA转录的诱导物有三种:PNP、4-硝基儿茶酚(4-NC)、γ-羟基粘康酸半醛,这三种诱导物之间不存在协同作用,但γ-羟基粘康酸半醛会减弱PnpR对PNP和4-NC的亲和力;PnpR1激活pnpA转录过程中的诱导物有两种:PNP和4-NC,这两种诱导物之间存在协同作用。通过检测重组菌株KT2440-pnpAB(pBBR-pnpR)、KT2440-pnpAB(p88R-pnpR1)和 KT2440-pnpAB(pBBR-pnpRR1)的PNP 降解性能,发现在 PnpR和 PnpR1 调控pnpA转录的过程中,PnpR1对pnpA的调控作用强于PnpR。为了研究PnpR对pnpC1C2的调控机制,将纯化后的PnpR与pnpC1C2启动子DNA进行体外结合实验,凝胶阻滞的结果表明PnpR可以与pnpC1C2启动子DNA结合,且这种结合不依赖于诱导物的存在。DNase I足迹实验结果表明,pnpC1C2启动子区域的一个29 bp的DNA序列模板“CAGTGTTTGCGAAACGCGAACACTGCTCA”是PnpR的结合位点,位于转录起始位点的上游,其相对位置为-82到-54;且诱导物PNP的存在能够增强PnpR与启动子区的结合强度。同样以gfp作为报告基因,研究PnpR激活pnpC1C2转录所需的诱导物,将pnpR与pnpC1 C2(PC1)的启动子DNA融合表达,以绿色荧光蛋白GFP作为报告基因原位检测pnpC1C2的转录,将构建好的质粒pBBR-pnpR-PC1-gfp导入P.putida KT2440中,利用荧光强度来检测转录是否激活,从而确定诱导物。实验发现该调控过程中存在三种诱导物:PNP、4-NC、γ-羟基粘康酸半醛。通过Western blot实验结果发现γ-羟基粘康酸半醛为最适诱导物,且三种诱导物之间存在协同作用,即当两种或三种诱导物同时存在时PnpR调控pnpC1C2的转录水平明显高于单个诱导物存在时。PnpA作为PNP降解的第一步反应的关键酶,对其催化机制的深入研究有助于深刻理解PNP降解过程的调控。因此,本论文通过定点突变技术初步研究了该酶的关键位点,为后续继续研究该酶的催化机制奠定理论基础。通过定点突变实验和相关的酶动力学分析结果,推测E42、Q115为FAD结合的关键位点;R179、R282为NADH结合的关键位点;D297可能为FAD结合的关键位点,也可能为NADH结合的关键位点;P304具体作用未知,但它的突变可引起酶的活性的丧失。