滇黄精多糖的理化性质、活性筛选与质量评价研究

来源 :大理大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lihai_feng
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目的:滇黄精为百合科多年生草本植物,是滇产大宗道地药材,课题组前期研究表明滇黄精多糖能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平,改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐量,降低餐后血糖值,降低血清总胆固醇和甘油三酯、增加高密度脂蛋白相对含量并降低低密度脂蛋白水平,显著增加肝、肌糖原含量,缓解糖尿病小鼠肾脏病理性结构变化,可修复糖尿病所引起的胰岛损害,这些结果说明滇黄精多糖对糖尿病具有一定的治疗作用。本研究从滇黄精多糖质量控制、分离纯化、化学组成、结构表征、体外抗氧化和降血糖活性的筛选进行研究,并对多基原黄精多糖质量等同性和滇黄精传统“九蒸九制”炮制中多糖的转化进行研究,以期为滇黄精多糖的开发利用奠定基础。方法:(1)收集不同产地滇黄精药材12批,采用傅里叶变换红外光谱仪建立红外指纹图谱,研究整体质量均一性;采用红外光谱和PMP-HPLC比较3种法定基原黄精中多糖的差异和质量均一性;紫外测定总多糖含量;(2)采用水提醇沉得到滇黄精总多糖(PKS),采用红外、紫外光法,HPLC法,试剂法分析多糖的理化性质并建立质量控制方法;通过分级醇沉将PKS纯化得到部位50%、70%、90%和95%沉淀物,经脱蛋白、透析除小分子,再经DEAE-琼脂糖凝胶FF离子交换柱和Sephadex G-100柱色谱纯化得到均一多糖,命名为PKS-1、PKS-2、PKS-4、PKS-5。进一步采用PMP-HPLC、高效凝胶渗透色谱法和红外光谱分别对其单糖组成、相对分子质量和结构进行研究;(3)采用脂肪细胞摄取葡萄糖模型和Hep G2细胞葡萄糖消耗模型对PKS、PKS-1、PKS-2、PKS-4、PKS-5的体外降血糖活性进行初筛;采用超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基清除实验评价PKS、PKS-1、PKS-2、PKS-4、PKS-5抗氧化活性;(4)采用红外光谱结合PCA分析对滇黄精“九蒸九制”炮制中化学成分的转化进行识别研究,采用高效凝胶色谱和紫外光谱进一步测定炮制中多糖组分和含量的变化。结果:(1)建立了12批滇黄精药材的红外指纹图谱,共有7个红外指纹特征峰,分别为3353.6 cm-1、2933.2 cm-1、1623.8 cm-1、1419.4 cm-1、1128.2 cm-1、1051.0 cm-1、825.4 cm-1,12批药材相似系数均大于0.9,表明滇黄精原料质量整体均一。3种法定基原黄精多糖的IR平均光谱和二阶导数图谱差异明显,PCA、PLS-DA和HCA分析均可将3种基原的黄精区分,滇黄精HCA聚为一类,PCA、PLS-DA散点较为集中,表明滇黄精多糖质量均一。柱前衍生化-HPLC图谱显示3种法定基原黄精中多糖的单糖组成存在差异,共有成分为D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖和L-岩藻糖。含量测定结果表明,所测样品多糖含量符合中国药典2015年版的要求。(2)对滇黄精总多糖PKS理化性质和含量测定结果表明PKS为含有多种单糖组成的酸性总多糖,其中含有蛋白质、色素等杂质,通过建立标准曲线计算得到PKS中多糖的纯度为67.2%,蛋白质的含量为17.1%,糠醛酸的含量为21.4%。从滇黄精总多糖PKS中分离纯化出6个均一多糖PKS-1、PKS-2、PKS-3、PKS-4、PKS-5、PKS-6;采用高效凝胶色谱法测得分子量分别为PKS-1 85017.83 Da、PKS-2 266084.76 Da、PKS-3474799.22 Da、PKS-4 14049.15 Da、PKS-5 7694.85 Da、PKS-6 3237.50 Da。经UV检测均不含蛋白质、核酸等杂质;PMP-HPLC衍生化结果表明PKS-1~PKS-5主要由D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-岩藻糖等单糖组成,且单糖的组成和含量差异较大。IR显示PKS-1~3在874 cm-1、890 cm-1和890 cm-1波长处有吸收,表明3个多糖均具有β糖苷键(C1-H的弯曲振动),PKS-4~5在820 cm-1、831 cm-1有吸收峰表明2个多糖均具有α糖苷键。刚果红实验结果表明PKS-1、PKS-2、PKS-3、PKS-4、PKS-5不具有三股螺旋构型。PKS-4核磁解析结构为由五种不同连接方式的果糖构成,分别为β-(2→1,6)-D-Fruf、β-(2→6)-D-Fruf,β-(2→1)-D-Fruf及β-(2→)-D-Fruf,而葡萄糖以α-D-(1→)Glcp形式与酮糖链连接。(3)体外降血糖初筛结果表明,总多糖PKS和均一多糖PKS-1、PKS-2、PKS-4、PKS-5均能明显促进Hep G2细胞葡萄糖的消耗,不具有促进脂肪细胞摄取葡萄糖作用。体外抗氧化结果表明PKS-1、PKS-2、PKS-4、PKS-5和PKS均具有一定的总还原力、DPPH自由基和-OH清除能力。(4)滇黄精颜色逐渐发生变化,生品呈现黄白色,八蒸八制、九蒸九制呈明显的滋润黑色。不同炮制品的IR平均光谱和二阶导数图谱差异明显,PCA模式识别均可将不同炮制滇黄精区分,HPGPC结果显示滇黄精生品中多糖组成主要以均一多糖PKS-4和PKS-5为主,九蒸九制炮制后多糖组成主要以小分子均一多糖PKS-6为主,推测原因是随着炮制次数的增加,生品中均一多糖PKS-4和PKS-5逐渐水解为PKS-6。含量测定结果表明,滇黄精直接晒干品多糖的含量最高,随着炮制次数的增加,多糖的含量先下降后趋于稳定。结论本研究对滇黄精多糖进行系统地分离纯化和理化性质进行研究,并进一步研究了其降血糖和抗氧化活性。此外,通过比较法定基原物种中多糖的质量等同性和滇黄精“九蒸九制”炮制中多糖的变化,为后续多糖的质量评价与功能性食品的开发提供依据。
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