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神经酸(nervonic acid)是大脑神经细胞和组织中的一种天然成分,也是世界公认的具有修复疏通受损大脑神经通路、恢复神经末梢活性、促进神经细胞生长和发育功能的重要物质。为此,神经酸已然成为预防和治疗大脑相关疾病的最佳选择。自然界中神经酸来源稀少,远远不能满足市场对其的需求。本文通过基因工程技术对解脂耶罗维亚酵母(yarrowia lipolytica)代谢途径进行改造,获得了产神经酸的解脂耶罗维亚酵母工程菌株。具体研究结果如下:(1)通过同源重组技术敲除URA3基因,获得了解脂耶罗维亚酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株URA3ˉpo1g。(2)采用Gibson Assembly方法,对解脂耶罗维亚酵母内源基因SCD(stearoyl-CoA desaturase)和DGA1(diacylgycerol acyltransferase 1),外源基因AtFAE1(fatty acid elongase 1 from Arabidopsis thaliana)、BtFAE1(fatty acid elongase 1 from Brassica tournefortii)、MaKCS(β-ketoacyl-CoA synthase from Microalgae)、MoKCS(β-ketoacyl-CoA synthase from Malania oleifera)和CgKCS(β-ketoacyl-CoA synthase from Cardamine graea)进行了表达质粒构建,获得了以下重组表达质粒:pMT-DGA1-SCD_HGR、pMT-BtFAE1-AtFAE1_LEU、pMT-MaKCS_URA、pMT-MoKCS_URA和pMT-CgKCS_URA。(3)采用醋酸锂转化法,将重组表达质粒pMT-DGA1-SCD_HGR、pMT-BtFAE1-AtFAE1_LEU成功导入URA3ˉpo1g酵母,获得了重组菌株URA3ˉPo1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1),在此基础上,分别导入重组表达质粒pMT-MaKCS_URA、p MT-MoKCS_URA和pMT-CgKCS_URA,成功获得了重组菌株URA3ˉPo1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-MaKCS)、URA3ˉPo1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-MoKCS)和URA3ˉPo1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-CgKCS)。(4)通过摇瓶发酵培养,分别采用氯仿-甲醇法和硫酸-甲醇法提取油脂和脂肪酸甲脂化,将得到的脂肪酸甲酯通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测,筛选到产神经酸的解脂耶罗维亚酵母工程菌株URA3ˉPo1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-CgKCS),其中URA3ˉPo1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-CgKCS)7号单克隆神经酸含量最高,占其油脂的1.5%,并且其油脂占细胞干重的比重是对照菌株URA3ˉPo1g的3倍。(5)建立了一套完整有效的解脂耶罗维亚酵母的分子生物学研究机制,为之后进行解脂耶罗维亚酵母产神经酸的产业化提供了理论和实验依据。