论文部分内容阅读
具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)是一种较为常见革兰氏阴性的厌氧菌,在口腔,肠道等以及其它身体部位中均有被发现。它有着很强的成膜性通过共聚作用形成生物被膜,加剧疾病的发展和治愈难度。同时F.nucleatum具有黏附和侵入功能其菌体表面特有的毒力因子能够增强黏附上皮细胞的能力。F.nucleatum已经被发现能够破坏牙周组织和牙龈组织,导致口腔疾病包括口臭和牙周炎等,最近几年发现F.nucleatum不仅和结直肠癌的产生并促进发展有着密切联系,还能够影响着肠道菌群稳态。卵黄免疫球蛋白(Ig Y)是经过特定致病源刺激后母鸡将体内产生的特定抗体转移到鸡蛋中,并从蛋黄里纯化得到,与哺乳动物中Ig G不仅有着结构的相似性最重要的是有着高效的免疫特性,由于其稳定性,廉价性和易获得性已经被应用在各个领域。基于其免疫特性,本研究使用抗F.nucleatum Ig Y干预具核梭杆菌诱导的相关口臭,牙周炎和结直肠癌,验证是否有较好的治疗效果以及简单的阐述其干预过程和部分相关机制。卵黄免疫球蛋白有效抑制具核梭杆菌的增殖。F.nucleatum经过灭活后加入辅助试剂制成疫苗注射到母鸡体内,收集蛋黄,离心去脂肪,按照1:6水溶去除脂肪,经过50%饱和硫酸铵沉淀,再经过14%硫酸钠沉淀,最后通过100k Da超滤管透析后,得到了高纯度的Ig Y并通过变性和非变性电泳进行了验证,得到了天然Ig Y分子量在180k Da左右,变性之后重链在70k Da左右,轻链在25k Da左右。F.nucleatum经过复苏,培养,革兰氏染色鉴定,并且测定了生长曲线,为后续实验做好了保证。经过ELISA测定了Ig Y效价高达25600,对于F.nucleatum生长有很好的抑制作用,为后续研究做好了基础的准备。卵黄免疫球蛋白治疗具核梭杆菌诱导的口臭。基于体外和动物模型,采用导致口臭的主要菌种F.nucleatum,诱导体外和动物口臭模型。在体外模拟体系中,采用了人工唾液模拟体系验证人工唾液模型的稳定性和有效性,在体系中模拟唾液中F.nucleatum生长,Ig Y能够很好抑制具核梭杆菌在人工唾液中的生长,有效地降低具F.nucleatum人工唾液产生的VSCs,使用GC/MS检测菌液中脂肪酸的变化,推测Ig Y影响了具核梭杆菌脂肪酸的代谢从而能够治疗口臭。大鼠口臭模型中,使用F.nucleatum涂抹牙周牙龈加上物理方法,造模一个月后,通过感官性评价,得到了较好的口臭模型。经过Ig Y治疗后,口臭指数得到很好的下降。随后采用SPME-GC/MS顶空固相法,检测了大鼠口臭模型唾液中挥发性有机化合物的变化,通过指定的数据库定性和半定量,最后得到了个4醇类,4个羧酸,3个酮类,2个醛类,2个酯类和1个含氮化合物,与之前文献中描述基本一致。经过Ig Y干预治疗后,尽管酮类和醛类物质没有太大的变化但是乙酸,丙酸和己酸含量显著的降低,另一个主要气味物质(氨气)在高剂量(40mg/m L)和低剂量(10mg/m L)治疗后,都得到了显著的缓解。卵黄免疫球蛋白治疗具核梭杆菌诱导的牙周炎。对大鼠牙周炎模型采用Ig Y治疗之后,从X光看出,牙齿之间的缝隙能够明显减小;从HE染色来看,牙槽骨吸收得到了很大的改善,牙周膜组织炎症浸渍减少,胶原纤维变得有序,都能说明Ig Y较好的治疗F.nucleatum诱导的牙周炎。Ig Y作用于F.nucleatum,减少F.nucleatum对于机体的侵袭和刺激,减少了炎症因子IL-6和TNF-α的释放。卵黄免疫球蛋白缓解具核梭杆菌诱导的结直肠癌。通过偶氮甲烷腹腔注射,饮用葡聚糖硫酸钠盐水溶液促进肠炎,加上F.nucleatum的诱导从而构造小鼠结直肠癌模型,研究卵黄免疫球蛋白对于小鼠结直肠肿瘤的影响。具核梭杆菌处理的小鼠结直肠肿瘤数目和肿瘤细胞增殖明显强于对照组,同时体现出炎症与结直肠癌的密切关系。本章节实验中发现F.nucleatum参与诱导的小鼠模型中不论是结直肠组织还是血清中TNF-α,COX-2和IL-8相对表达水平和血液中含量均显著高于对照组,同时小鼠体重,肿瘤数目,毛色等症状都与对照组有很大的差异,但是经过Ig Y干预后,首先体重相对之前有较好的恢复,肿瘤数目减少其次TNF-α,COX-2和IL-8水平得到下降,说明F.nucleatum对于炎症有着重要的影响,同时Ig Y能够通过NF-κB通路缓解结直肠组织中炎症的情况从而改善结直肠肿瘤的发生的风险。