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第一部分:早期凋亡特异性小分子探针的构建与表征目的:建立一套早期凋亡特异性小分子探针CYS-F合成与制备方法,并在体外验证其细胞毒性及早期凋亡靶向性,为进一步体内研究奠定基础。材料与方法:采用一步法将胱氨酸(cystine)和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)反应,利用高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)对反应产物分离纯化,并使用液质联用仪(Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy,LC-MS)进行分子量测定。将合成的小分子探针CYS-F设置六个不同浓度(Oμg/mL,25 μg/mL,250μg/mL,625 μg/mL,1250 μg/mL,2500 μg/mL),与 1x107 的 Hela 细胞在 37℃下避光孵育 24小时,同时每个探针浓度做6个复孔,最后用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)将未结合的探针洗去。应用细胞活性检测试剂盒CCK-8(Cell Counting Kit-8)进行细胞活性检测分析。接着,体外实验验证不同凋亡诱导条件下小分子探针的靶向性:首先,用阿霉素诱导Hela细胞凋亡,PBS作为对照组,干预2小时后,两组细胞分别与筛选出的适宜浓度探针CYS-F、对照探针进行孵育15分钟,PBS清洗3次后,相互对比,验证其靶向性;为验证探针靶向能力的普适性,用紫杉醇诱导Hela细胞凋亡,药物干预12小时后,PBS清洗3次清除残余药物,再将筛选出的适宜浓度探针CYS-F添加进培养基,孵育15分钟,PBS清洗3次除去残余探针,然后进行annexin V与propidium iodide(PI)染色,或是7-amino-actinomycin D(7-ADD)/annexin V染色,annexin V是细胞凋亡特异性的标志物,而PI和7-ADD是细胞坏死的标志物,然后在荧光显微镜下进行观察,分析探针早期凋亡靶向性。结果:一步法合成的小分子探针CYS-F利用HPLC分离纯化后,利用LC-MS测量出的分子量为1013 Dalton(Da)。细胞毒性实验结果显示设置的六个不同浓度的探针均未对细胞产生明显的细胞毒性(P>0.05)。在荧光显微镜下,阿霉素诱导的凋亡细胞为因阿霉素自身的荧光而显示为红色,而探针阳性的细胞显示为绿色,两者有很好的共定位,而在正常细胞未发现明显的荧光信号,表明小分子探针CYS-F能够特异性靶向凋亡细胞,而不被正常细胞吞噬;当对照探针与凋亡诱导细胞和正常细胞孵育后,无论凋亡诱导细胞或是正常细胞均显示为绿色,证明对照探针并无凋亡细胞靶向性。而当用紫杉醇诱导凋亡时,探针阳性的细胞与早期凋亡特异性标志物annexin V有很好的共染,同时可以观察到annexin V主要集中在细胞表面,而小分子探针CYS-F集中于胞质内;此外探针CYS-F阳性的细胞与PI阳性的细胞或是7-ADD阳性的细胞没有明显的共定位,再次验证了小分子探针的靶向性,并且探针的靶向性具有普适性。结论:利用一步法成功合成了早期凋亡特异性小分子探针CYS-F,且该探针没有明显的细胞毒性。更为重要的是,在不同的凋亡诱导条件下,小分子探针CYS-F均表现出优异的早期凋亡靶向性,且与早期凋亡经典的标志物annexinV相比,该小分子探针能够集中在凋亡细胞胞质内,从而提高成像信噪比,为进一步活体成像提供了实验基础。第二部分:急性缺血性脑卒中早期凋亡多模态成像的实验研究目的:探究小分子探针CYS-F在体内的分布规律,并基于小鼠光栓法急性缺血性脑卒中模型应用7.0T磁共振和近红外光学成像活体动态观察小分子探针CYS-F反映急性脑卒中后早期凋亡的发生发展规律。材料与方法:选择4-6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠共6只,尾静脉注射分子探针CYS-F,于注射探针后0,0.5,1,2,3,6,12小时眼眶采血约0.1mL,测定血浆内探针浓度,分析小分子探针的血液循环规律;同时在最后一次采血后1%戊巴比妥钠氯化钠溶液过量麻醉处死小鼠,分别取心、肝、脾、肺、肾、脑进行离体近红外扫描,观察探针分布情况。基于光栓法构建小鼠急性缺血脑卒中模型,造模后即刻尾静脉注射探针CYS-F和对照探针,分别于造模后0,1,3,6,8,12,24小时进行近红外成像,研究荧光信号在病灶处的时间一强度曲线。于造模后24小时行磁共振扫描,确定最终病灶面积,将近红外图像与磁共振图像进行匹配,同时离体取组织进行病理切片,annexin V免疫荧光染色,验证小分子探针在体内的早期凋亡靶向性。同时进行MAP-2和NeuN免疫荧光染色,确定凋亡细胞类型。结果:小分子探针在血液循环中快速代谢,半衰期约为1.3小时,且主要经过肾脏排泄。在急性缺血性脑卒中模型中,与对照探针相比,靶向探针在病灶处表现出明显的荧光信号。同时在造模后6小时左右病灶处的荧光信号达到峰值,这反映急性缺血性脑卒中后早期凋亡在六小时左右达到高峰。同时最终的近红外荧光成像与磁共振成像有很好的图像匹配。有趣的是,在造模后静脉注射探针时可以观察到病灶处的荧光信号反而弱于周围信号强度。免疫荧光染色显示CYS-F探针阳性的细胞与annexin V阳性的细胞共染,同时部分探针阳性细胞与神经元标志物MAP-2、NeuN存在共染。结论:小分子探针CYS-F能够在体内快速分布,并经过肾脏排泄。同时小分子探针CYS-F能够反应急性脑卒中后早期凋亡的发生发展规律。更为重要的是,CYS-F在体内早期能够反应局部组织血流灌注情况。第三部分:多模态分子影像指导急性缺血性脑卒中抗凋亡治疗目的:基于前期得到多模态分子影像成像结果,通过磁共振成像和近红外成像指导并评价胱胺在急性缺血性脑卒中发挥的抗凋亡的作用。材料与方法:选择4-6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠共18只,随机分为三组,对照组,高剂量治疗组,低剂量治疗组,每组6只。利用光栓法建立光栓大脑中动脉急性缺血性脑卒中模型,在造模后按照分组给与药物进行治疗:0.9%生理盐水(对照组),50mg/kg胱胺(低剂量治疗组),100mg/kg胱胺(高剂量治疗组)。同时尾静脉注射分子探针CYS-F,于造模后6小时进行近红外成像,在造模后24小时进行磁共振成像,测定病灶区域的荧光信号强度以及病灶面积大小,进行组间比较,同时将两种成像结果进行匹配,分析两者相关性。结果:在小鼠急性缺血性脑卒中造模后6小时,近红外成像发现,胱胺治疗组相较于对照组病灶处的荧光信号明显减弱(P<0.001),同时随着胱胺剂量的增加,病灶处的荧光信号进一步减弱;在造模后24小时磁共振成像上也发现同样的结果,治疗组的病灶面积明显小于对照组,同时病灶面积随着胱胺剂量的增加而逐渐减小。同时6小时的近红外成像结果与24小时磁共振成像结果有很好的相关性(R2 = 0.875,P<0.001)。结论:基于小分子早期凋亡探针CYS-F的多模态成像能够指导并监测胱胺在急性缺血性脑卒中的治疗作用,且该小分子探针能够在发病早期预测疾病转归。