以石英为代表的微米SiO2是典型的肺毒物，可引起矽肺，其致癌作用已有足够的动物实验证据和人群流行病学调查证据，1997年IARC（国际癌症研究机构）确定其为Ⅰ类致癌物。纳米SiO2与微米SiO2的化学组分相同，广泛应用于几乎涉及微米SiO2粉体的所有领域，其生物安全性的研究尤为重要。目前对于纳米SiO2的肺毒性研究尚没有统一、明确的结论。有研究报道纳米SiO2染尘小鼠或大鼠后，未观察到明显的肺部炎症反应及病理学改变。而另一些研究发现小鼠经气管灌注胶体纳米和微米SiO2，0.5～24h内纳米SiO2导致更为严重的肺部炎症反应;纳米和微米SiO2染尘大鼠3天，纳米SiO2致肺部出现较微米SiO2强的急性炎症反应;纳米SiO2染尘大鼠1个月后，出现肺损伤，氧化损伤、炎症反应及细胞凋亡可能在纳米SiO2颗粒致肺损伤过程中起重要作用;另有文献报道纳米SiO2染尘大鼠30、60天，能引起肺部纤维化，程度较微米SiO2轻。由此可以看出纳米SiO2在染毒的不同阶段所致肺损伤不同，且损伤程度与同浓度微米SiO2也不同。近年来，microRNA(miRNA)作为一种非编码小RNA因其广泛的基因调节作用引起了科学界的关注，随着对miRNA表观遗传学机制的逐步了解，为肺损伤发生发展分子机制的研究提供了新思路。有研究发现miR-16、miR-127等可能在脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤过程中起作用，在博莱霉素诱导小鼠或大鼠肺纤维化的模型中发现miR-21、miR-29家族、miR-126、miR-155等在其中起着重要作用。miRNA靶基因分析显示let-7f可能参与博来霉素诱发的肺损伤晚期纤维化信号通路主要相关基因的表达;囊肿性肺纤维化病人肺内上皮细胞的miR-126表达下降，同时miR-126可以调节TLR2/4信号通路的TOM1基因的表达。上述研究提示miRNA可通过多种途径调控肺损伤过程。通过研究miRNA在纳米SiO2致肺损伤过程中的差异性表达，有助于更深入了解纳米SiO2致肺损伤的发生发展机制和寻找纳米SiO2致肺损伤分子调控靶点。本研究在前期实验研究的基础上，建立经气管灌注纳米SiO2致大鼠肺损伤的模型，利用Illumina HiSeq2000测序技术对正常、不同剂量和时间纳米SiO2对大鼠染毒后肺组织的miRNAs表达谱进行分析，筛选差异表达的miRNAs，探讨miRNA在纳米SiO2致肺损伤过程中的生物学功能，为揭示纳米SiO2肺脏毒作用的分子机制及生物标志物，评价其安全性及制订卫生标准提供科学依据。实验结果如下:　　1.健康SPF级雄性SD大鼠150只，按体重随机分为生理盐水组、6.25、12.5、25mg/mL纳米SiO2及25mg/mL微米SiO2染尘5个组，每组30只，一次性气管注入1mL混悬液7、15、30、60及90天后，分别从各剂量组中随机选取6只大鼠进行实验。结果发现在所有染尘时间点，6.25、12.5mg/mL纳米SiO2组大鼠肺脏器系数较生理盐水组增加，差异无统计学意义(P＞0.05)，25mg/mL纳米、微米SiO2组大鼠肺脏器系数均高于生理盐水组(P＜0.05)，25mg/mL微米SiO2组大鼠肺脏器系数高于同剂量纳米SiO2组(P＜0.05)，染尘7、15天25mg/mL纳米SiO2组大鼠肺脏器系数高于6.25、12.Smg/mL纳米SiO2组(P＜0.05);随染尘时间延长，各剂量纳米SiO2组大鼠肺脏器系数降低，25mg/mL微米SiO2组大鼠肺脏器系数增高，呈现时间-效应关系。光学显微镜下可见6.25、12.5mg/mL纳米SiO2染尘7、15天，大鼠肺泡间隔略有增宽、炎症细胞浸润，30、60、90天肺泡间隔增宽，支气管及血管周围、小叶间隔有纤维结缔组织沉积;25mg/mL纳米SiO2染尘7天肺组织局灶性肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)聚集、纤维母细胞增生和实变，15天局灶性肺泡壁和小叶间隔增宽，纤维结缔组织增生，30、60、90天支气管和血管周围、肺泡壁和小叶间隔增宽，纤维结缔组织轻度增生;25mg/mL微米SiO2染尘7天大鼠肺泡腔内及AM聚集，形成细胞性结节，15天肺内弥漫性分布细胞性结节，30天少量结节融合，60天大量结节融合，90天肺内有细胞纤维性结节，其周围肺泡呈代偿性肺气肿。透射电镜下可见25mg/mL纳米SiO2染尘后7天Ⅱ型肺泡上皮细胞嗜锇板层小体肿胀，染尘15、30、60、90天Ⅱ型肺泡上皮细胞嗜锇板层小体增多、肿胀，空泡样变，间质中胶原纤维及弹力纤维增生;25mg/mL微米SiO2染尘7天Ⅱ型肺泡上皮细胞嗜锇板层小体肿胀，间质中胶原纤维及弹力纤维增生，染尘15、30、60、90天Ⅱ型肺泡上皮细胞胞质内嗜锇板层小体增多，间质中胶原纤维及弹力纤维增生，嗜锇板层小体空泡样变。以上结果提示纳米SiO2颗粒可致大鼠肺损伤，早期（7、15、30天）以炎症为主，后期（60、90天）则主要表现为肺间质纤维化，不同于微米SiO2所致结节性肺纤维化，其致纤维化能力较同浓度微米SiO2弱。　　2.Illumina HiSeq2000测序技术分析纳米SiO2致大鼠肺损伤miRNA表达谱变化。将测序结果与miRNA数据库比对，筛选出各染尘组在不同染尘时间与对照组相比表达变化在2倍以上且共同差异表达的miRNA，运用microRNA.org、 miRDB、Targetscan三个靶基因预测软件同时进行预测，通过Gene Ontology和京都基因与基因组百科全书分别对靶基因进行功能分类和pathway分析。结果显示6.25、12.5、25mg/mL纳米SiO2及25mg/mL微米SiO2染尘组大鼠肺组织中各染尘时间点miRNA表达上调数量分别为395、314、278、241个，下调数量分别为127、167、135以及412个。染尘早期各剂量纳米SiO2染尘组大鼠肺组织共同差异上调表达miRNA为miR-208与miR-212，染尘后期共同差异上调表达miRNA为miR-18a;实时荧光定量PCR检测结果表明大鼠肺组织中miR-208、miR-212及miR18a显著上调，与Illumina HiSeq2000测序结果一致。TargetScan靶基因预测显示miR-208、miR-212、miR-18a的靶基因分别有146、310、184个。GO及pathway分析结果表明，miR-208主要涉及肺发育、肺形态发生、肺叶形成等，参与的信号通路主要包括T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路等;miR-212主要涉及肺发育、间质发育、MAPK级联调节、胰岛素生长因子受体信号通路、表皮生长因子受体信号通路等，参与的信号通路主要包括MAPK信号通路、趋化因子信号通路、TGF-β信号通路等;miR-18a主要涉及肺脏发育、结缔组织发育、TGF-β刺激应答等，参与的信号通路主要包括MAPK信号通路、内吞作用、癌症信号通路等。以上结果提示纳米SiO2致大鼠肺损伤存在miRNA差异性表达，纳米SiO2染尘组早期共同差异上调表达的miRNA为miR-208、miR-212，后期共同差异上调表达的miRNA为miR-18a，主要参与肺发育、MAPK信号通路及TGF-β信号通路等，它们可能是纳米SiO2致大鼠肺损伤中起调控作用的miRNA。　　3.靶基因分析及文献报道显示miR-208、212可能分别通过其靶基因程序性死亡因子4(PDCD4)、LIN28B参与炎症信号通路的调控，miR-18a通过其靶基因结缔组织生长因子(CTGF)参与组织纤维化的形成。运用实时荧光定量PCR、免疫印迹杂交技术，在mRNA转录水平及蛋白表达水平分别检测生理盐水组及纳米SiO2染尘7天大鼠肺组织中PDCD4、LIN28B以及染尘60天大鼠肺组织中CTGF的差异，统计分析结果显示，纳米SiO2染尘7天大鼠肺组织中的PDCD4、LIN28B基因mRNA与生理盐水对照组相对表达水平分别为1.02±0.02、1.04±0.05，差异无统计学意义(P＞0.05)，以β-actin为内参对照，蛋白灰度值比值分别为0.27±0.02与1.14±0.15、1.19±0.12与0.23±0.04，差异有统计学意义(P＜0.05);纳米SiO2染尘60天大鼠肺组织中的CTGF基因mRNA的相对表达水平是1.97±0.06，差异无统计学意义(P＞0.05)，以β-actin为内参对照，蛋白灰度值比值分别为1.04±0.12与0.06±0.01，差异有统计学意义(P＜0.05)。以上结果提示miR-208、miR-212及miR-18a对靶基因PDCD4、LIN28B、CTGF的mRNA表达水平没有明显影响，但可影响它们的蛋白表达水平，提示其可能在靶基因的翻译水平参与纳米SiO2致大鼠肺损伤的调控作用。　　综上所述，本研究结果显示纳米SiO2暴露可引起大鼠肺损伤，早期以炎症为主，后期则主要表现为肺间质纤维化。miR-208、miR-212以及miR-18a可能在纳米SiO2致大鼠肺损伤过程中起调控作用，其在靶基因PDCD4、LIN28B、CTGF的翻译水平参与纳米SiO2致大鼠肺损伤的调控作用。