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目的:1.观察DAIa2GIP拮抗IL-1β诱发软骨细胞线粒体凋亡的效应;2.探讨DAIa2GIP拮抗软骨细胞损伤的分子机制;3.为骨关节炎药物治疗提供新的思路,寻找新的突破,同时为骨关节炎的转化医学研究提供实验依据。方法:本实验选取SD大鼠出生7日幼鼠的肋软骨细胞,仔细分离消化后用含1%双抗、10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养,制作细胞爬片利用免疫组化法进行细胞鉴定,选取培养的第三代细胞进行实验。将细胞在上述培养基基础上不同处理后分为6组,具体为:(1)正常对照组:原培养基基础上不添加其他药物;(2)IL-1β诱导组:加入IL-1β(10 ng/m L);(3)IL-1β+DAla2GIP孵育组:加入IL-1β(10 ng/m L)、DAla2GIP(100p M);(4)IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP(GIPR拮抗剂)孵育组:加入IL-1β(10 ng/m L)、DAla2GIP(100p M)、pro3 GIP(100p M);(5)DAla2GIP孵育组:加入DAla2GIP(100p M);(6)pro3GIP孵育组:加入pro3GIP(100p M)。在相同环境下孵育48h后,各组细胞进行线粒体膜电位检测、Annexin-V FITC kit(磷脂酰丝氨酸外翻分析)细胞凋亡检测、激光共聚焦显微镜细胞钙超载测定、ELISA法测定细胞色素C含量及Western Blot法检测P53、Bcl-2含量。结果:1.SABC免疫组织化学法鉴定所提取细胞为软骨细胞,细胞生长良好,密集区域细胞多呈现圆形,稀疏区域细胞多呈多角形。取第三代细胞进行后续实验。2.线粒体膜电位及Annexin-V FITC kit(磷脂酰丝氨酸外翻分析)细胞凋亡检测:(1)软骨细胞线粒体膜电位保持程度(流式细胞学):IL-1β+DAla2GIP孵育组(93.15%±0.07%)明显高于IL-1β诱导组(81.00%±1.48%)(P<0.01);IL-1β诱导组与IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(81.65%±2.26%)无明显统计学差异(P>0.05),且两组均低于正常对照组(95.10%±0.42%)(P<0.01);正常对照组、DAla2GIP孵育组(94.95%±0.49%)及pro3GIP孵育组(92.95%±0.35%)均无明显统计学差异(P>0.05)。(2)软骨细胞线粒体膜电位保持程度(荧光显微镜):IL-1β+DAla2GIP孵育组(93.36%±2.34%)明显高于IL-1β诱导组(89.86%±1.76%);IL-1β诱导组与IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(89.07%±1.40%)无明显统计学差异,且两组均低于正常对照组(95.43%±1.31%)(P<0.01);正常对照组、DAla2GIP孵育组(93.9%±2.28%)及pro3GIP孵育组(93.5%±1.56%)均无明显统计学差异(P>0.05)。(3)软骨细胞凋亡率(流式细胞学):IL-1β+DAla2GIP孵育组(1.05%±0.05%)明显低于IL-1β诱导组(3.85%±0.55%)(P<0.01);IL-1β诱导组与IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(3.25%±0.25%)无明显统计学差异(P>0.05),且两组均高于正常对照组(0.95%±0.15%)(P<0.01);正常对照组、DAla2GIP孵育组(1.7%±0.4%)及pro3GIP孵育组(1.1%±0.4%)均无明显统计学差异(P>0.05)。(4)软骨细胞凋亡程度(荧光显微镜):IL-1β+DAla2GIP孵育组(6.63%±2.34%)明显低于IL-1β诱导组(10.13%±1.76%)(P<0.01);IL-1β诱导组与IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(10.9%±1.40%)无明显统计学差异(P>0.05),且两组均高于正常对照组(4.5%±0.75%)(P<0.01);正常对照组、DAla2GIP孵育组(6.1%±2.29%)及pro3GIP孵育组(6.5%±1.56%)均无明显统计学差异(P>0.05)。3.激光共聚焦显微镜细胞钙超载测定(结果以荧光强度表示):IL-1β+DAla2GIP孵育组(52.59±3.00)较之IL-1β诱导组(62.72±6.29)显著降低(P<0.01);IL-1β诱导组与IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(62.87±3.75)无明显统计学差异(P>0.05),两组较之正常对照组(51.79±3.76)均显著增高(P<0.01);正常对照组、DAla2GIP孵育组(51.18±2.61)及pro3GIP孵育组(52.26±6.29)三组之间均无明显统计学差异(P>0.05)。4.ELISA法测定细胞色素C含量结果:相比较于IL-1β诱导组(251.833nmol/L±19.16nmol/L),IL-1β+DAla2GIP孵育组(189.853nmol/L±36.48nmol/L)显著降低(P<0.01);IL-1β诱导组与IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(232.533nmol/L±15.38nmol/L)无明显统计学差异(P>0.05),且两组相比较于正常对照组(173.473nmol/L±35.16nmol/L)均显著增高(P<0.01);正常对照组、DAla2GIP孵育组(184.583nmol/L±33.748nmol/L)及pro3GIP孵育组(187.413nmol/L±14.43nmol/L)三组之间均无明显统计学差异(P>0.05)。5.Western Blot法检测P53含量结果(以相对灰度值进行比较):IL-1β+DAla2GIP孵育组(114.21%±6.62%)较IL-1β诱导组(141.37%±11.71%),明显降低(P<0.01);IL-1β诱导组与IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(139.39%±12.87)差异不明显(P>0.05),且两组均高于正常对照组(100.00%±14.47%)(P<0.01);正常对照组、DAla2GIP孵育组(98.94%±16.03%)及pro3GIP孵育组(94.96%±16.65)三组之间均无明显差异(P>0.05)。6.Western Blot法检测Bcl-2含量结果(以相对灰度值进行比较):IL-1β+DAla2GIP孵育组(109.87%±14.64)较IL-1β诱导组(60.18%±6.74%),明显增高(P<0.01);IL-1β诱导组与IL-1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(60.88%±8.80)无明显差异(P>0.05),且两组相比较均低于正常对照组(100%±9.09%)(P<0.01);正常对照组、DAla2GIP孵育组(96.32%±8.35%)及pro3GIP孵育组(97.82%±7.57%)三组之间均无明显差异(P>0.05)。结论:1.DAla2GIP孵育可减轻IL-1β诱导的大鼠软骨细胞线粒体功能障碍;2.DAla2GIP孵育拮抗IL-1β诱导的大鼠软骨细胞凋亡;3.DAIa2GIP通过抑制IL-1β诱导的大鼠软骨细胞内钙超载,并下调P53表达来促进Bcl-2蛋白的表达,从而保护线粒体膜电位稳定,减少了细胞色素C的释放,达到抑制大鼠软骨细胞凋亡的作用。