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目的:恶性肿瘤目前已经成为人类死亡的主要疾病,尽管针对肿瘤的靶向治疗发展迅速,但是总体治疗效果仍然不够理想。大量临床研究表明,肿瘤的免疫逃逸是造成肿瘤治疗失败的主要因素。本研究中,我们通过探索长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA ) AK036396对粒细胞样髓源性抑制细胞(Granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs)发育及功能的调控,寻找肿瘤免疫治疗的新靶点。方法:1.采用Arraystar LncRNA表达谱芯片技术检测在野生型小鼠脾脏来源CDllb+Ly6G+细胞与荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中表达的lncRNA,筛选出表达呈现明显差异的lncRNA,并利用实时荧光定量定量PCR(realtimefluorescene quantitative PCR, qRT-PCR)进行进一步的确认;利用 qRT-PCR 分析 lncRNA AK036396在不同髓系细胞以及不同发育阶段G-MDSCs中的表达。2.分析Arraystar LncRNA表达谱芯片,筛选出lncRNA可能调控的靶分子,并使用qRT-PCR进行进一步验证。利用qRT-PCR与Western-blot检测在不同髓系细胞中靶分子Fcnb的表达情况。利用特异性siRNA抑制G-MDSCs中lncRNA AK036396的表达后,利用qRT-PCR与Western-blot检测细胞中靶分子Fcnb的表达变化。3.利用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH )确定 lncRNA AK036396在G-MDSCs细胞中定位;利用RNA pull down与RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验确认 lncRNA AK036396与Fcnb蛋白是否存在结合;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,加入蛋白合成抑制剂环已酰亚胺(Cycloheximide, NCX )(40μg/mL),随后利用 Western-blot 确认 lncRNAAK036396 对 Fcnb 蛋白稳定性的调控;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,加入蛋白酶体抑制剂MG132 (20pM),随后利用Western-blot确认lncRNAAK036396对Fcnb蛋白稳降解的调控;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,随后通过免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)实验确认lncRNAAK036396对Fcnb蛋白泛素化的调控。4.为了确认Fcnb与G-MDSCs发育及功能的联系,利用小鼠Fcnb特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中Fcnb后,检测①利用qRT-PCR检测细胞中CD244的表达;②G-MDSCs免疫抑制功能变化,其中包括:利用比色法检测精氨酸酶1 (Arginase1,Arg1)活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测活性氧(Reactive oxygen species, ROS)表达。5.肿瘤局部注射小鼠Fcnb特异性siRNA后,①连续监测肿瘤生长情况;②使用FCM检测肿瘤组织中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR检测肿瘤来源G-MDSCs中CD244表达情况;④肿瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表达变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用FCM检测ROS表达;⑤FCM检测脾脏、引流淋巴结、肿瘤局部CD3+CD4+IFN-γ+ T细胞和CD3+CD8+IFN-γ+ T细胞比例。6.为了确定lncRNA AK036396对G-MDSCs发育及功能的调控,利用小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396后,①检测G-MDSCs发育变化,其中包括:使用qRT-PCR和Western-blot检测Fcnb的表达、使用qRT-PCR检测CD244的表达、通过瑞氏-吉姆萨染色检测细胞形态学改变;②检测G-MDSCs免疫抑制功能变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用FCM检测ROS表达。7.肿瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA后,①连续监测肿瘤生长情况;②FCM检测肿瘤组织中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR与Western-blot检测肿瘤局部G-MDSCs中Fcnb的表达,利用qRT-PCR检测肿瘤局部G-MDSCs中CD244的表达;④肿瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表达变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用FCM检测ROS表达;⑤FCM检测脾脏、引流淋巴结、肿瘤局部 CD3+CD4+IFN-γ+ T 细胞和 CD3+CD8+IFN-γ+ T 细胞比例。8.利用qRT-PCR检测肺癌患者外周血单个核细胞(PBMCs)中小鼠Fcnb同源物M-ficolin的表达水平,并分析M-ficolin的表达水平与肺癌发展之间的联系。结果:1.与野生型小鼠脾脏来源CD11b+Ly6G+细胞相比,lncRNAAK036396在肿瘤来源G-MDSCs中高表达(P<0.001);与外周成熟中性粒细胞(P<0.001)、单核细胞(P<0.001)以及肿瘤来源 M-MDSCs (P<0.001)相比,lncRNAAK036396 在荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中高表达;lncRNAAK036396的表达随着G-MDSCs分化发育逐渐下降(P<0.05)。2.与野生型小鼠脾脏来源CD11b+Ly6G+细胞相比,Fcnb在肿瘤来源G-MDSCs中高表达(P<0.01);与外周成熟中性粒细胞(P<0.001)、单核细胞(P<0.001)以及肿瘤来源M-MDSCs (P<0.001)相比,Fcnb在荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中的表达水平最高;在肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396表达被抑制后,FcnbmRNA (P<0.05)与蛋白(P<0.05)表达发生显著下调。3.通过FISH实验发现lncRNAAK036396主要位于肿瘤来源G-MDSCs细胞核中;通过RNA pull down和RIP实验证实lncRNAAK036396与Fcnb蛋白之间存在相互结合;Western-blot结果显示在抑制G-MDSCs中lncRNAAK036396表达后,Fcnb蛋白稳定性显著下调;Western-blot结果显示在抑制蛋白酶体活性后,siAK036396无法继续下调Fcnb蛋白稳定性;IP结果显示,抑制lncRNAAK036396表达后,Fcnb蛋白结合的泛素水平显著升高。4.利用小鼠Fcnb特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中Fcnb后,①CD244的表达显著下调(P<0.01);②Arg1活性显著下调(P<0.05)、ROS表达显著下调(P<0.05)、G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用下调(P<0.05)。5.肿瘤局部注射小鼠Fcnb特异性siRNA后,①肿瘤生长被有效延缓(P<0.05);②肿瘤组织中G-MDSCs比例发生显著下调(P<0.05);③肿瘤来源G-MDSCs中CD244的表达显著下降(P<0.05);④肿瘤局部来源G-MDSCs中Arg1活性(P<0.01)、ROS表达(P<0.05)均发生显著下调;⑤脾脏(P<0.05)、肿瘤局部(P<0.05) CD3+CD4+IFN-γ+T细胞比例出现显著上调。同时,脾脏(P<0.05)、肿瘤局部(P<0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T细胞比例出现显著上调。6.在肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396表达被抑制后,①Fcnb(P<0.05)和CD244 (P<0.01)表达均发生显著下调,G-MDSCs形态学特点由杆状核为主分页核少见转变为多见分页核;②Arg1活性显著下调(P<0.05)、G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用下调(P<0.05),但是ROS的表达未出现显著变化(ns=no significance)。7.肿瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA后,①肿瘤生长被有效延缓(P<0.001);②肿瘤组织中G-MDSCs比例发生显著下调(P<0.01);③肿瘤局部来源G-MDSCs中Fcnb (P<0.01)与CD244 (P<0.001)的表达显著下调;④肿瘤局部来源G-MDSCs中Arg1活性(P<0.05)与ROS的表达(P<0.001)发生显著下调;⑤脾脏(ns)、引流淋巴结(ns)、肿瘤局部(ns) CD3+CD4+IFN-γ+T细胞比例未出现显著变化。但是脾脏(P<0.05)、引流淋巴结(P<0.05)、肿瘤局部(P<0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T细胞比例均出现显著升高。8.与健康对照相比较,肺癌患者PBMCs中M-ficolin (小鼠Fcnb的同源物)的表达水平显著升高(P<0.05)。肺癌患者PBMCs中M-ficolin表达水平与MDSCs比例及Arg1表达水平呈现明显的正相关(P<0.01, P<0.05)。且M-ficolin的表达水平与肿瘤大小(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.001)、TNM分期(P<0.05)密切相关。结论:LncRNAAK036396在肿瘤来源G-MDSCs中的表达呈现阶段特异性与细胞特异性。LncRNAAK036396通过Fcnb能够有效调控G-MDSCs免疫抑制功能进而影响机体抗肿瘤免疫。