Hedgehog(Hh)通路在胚胎的发育，损伤再生及肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。异常的Hh信号会导致肿瘤的发生和发展。已知成熟的Hh蛋白可以通过结合其受体Ptch1蛋白从而释放Ptch1对Smoothened(SMO)的抑制作用，SMO进一步被转运到初级纤毛上，通过一系列细胞内反应激活下游基因表达。但Hh和Ptch1调控SMO的具体分子机制还知之甚少，这是Hh通路里的一个中心问题。1996年，Philip Beachy实验室报道Hh可以被胆固醇共价修饰。胆固醇修饰对Hh蛋白的分布和功能有重要影响。近20年来，Hh一直被认为是唯一的胆固醇修饰蛋白。本课题的研究目的就是探究是否还存在除了Hh以外的其他胆固醇修饰蛋白。　　为了回答上述问题，我们合成了一个新的胆固醇探针(Cholesterol probe，CP)，并证明CP可以代替胆固醇的部分功能，如支持细胞生长和修饰Hh。利用化学生物学策略，我们建立了一套可以鉴定新的胆固醇修饰蛋白的方法。结合大规模纯化和质谱鉴定，我们发现了20种只在加胆固醇探针组出现的胆固醇修饰候选蛋白。我们对其进行一一验证后，发现只有SMO可以被胆固醇共价修饰。为了确认SMO的胆固醇修饰，并鉴定其修饰位点，我们免疫沉淀了SMO蛋白，质谱鉴定确认了SMO可以被胆固醇修饰，而且修饰位点在其N端的第95位天冬氨酸(D95)上。和质谱鉴定结果一致的是，SMO(D95N)突变体可以完全阻止SMO的胆固醇修饰。进一步，我们发现Hh可以促进SMO的胆固醇修饰，Ptch1可以抑制该修饰。以上结果提示，Hh和Ptch1通过调控SMO的胆固醇修饰而实现Hh通路的信号转导。　　为了探究胆固醇修饰对SMO的作用，我们对野生型SMO(WT)和SMO(D95N)突变体进行了纤毛转运和Gli荧光素酶报告系统分析。发现无论在减或加Hh蛋白处理下，D95位的胆固醇修饰对SMO向纤毛上的转运及Hh通路的激活都是必须的。为了进一步探索胆固醇修饰在小鼠体内的作用，我们构建了Smo(D99N)Knock In小鼠（小鼠SMO的D99等同于人SMO的D95），发现纯合的Knock In小鼠(SmoD99N/D99N)胚胎致死，表现出严重的发育障碍，该表型与Smo基因敲除表型几乎完全相似。以上结果证明，SMO的胆固醇共价修饰对Hh信号通路的活性与功能至关重要。　　综上所述，本工作首先建立了一套鉴定新的胆固醇修饰蛋白的方法，并且利用此方法发现了新的胆固醇修饰蛋白SMO;我们进而证明Hh和Ptch1通过影响SMO的胆固醇修饰来调控SMO的活性与信号转导;最后，我们分别在细胞水平和Knock In小鼠体内证明了SMO的胆固醇修饰对Hh通路激活和胚胎发育的重要性。该研究还为治疗Hh通路相关癌症提供了新的靶点。　　除此之外，我们还探究了施耐德角膜营养不良症(Schnyder corneal dystrophy，SCD)的发病机理。发现UbiA prenyltransferase domain containing1(UBIAD1/TERE1)基因致病突变体可以通过竞争Insig蛋白和胆固醇合成限速酶HMGCR的结合，抑制Insig-gp78复合物对HMGCR的泛素化降解，使HMGCR稳定性增加，从而增加内源胆固醇的合成。另外，已知抑制SREBP(Sterol regulatory element-binding protein)通路可以减少胆固醇，脂肪酸，甘油三酯的合成，降低脂质水平，对代谢类疾病有良好的效果。我们通过Sterol Regulated Element(SRE)原件驱动的荧光素酶报告系统对上海生物化学与细胞生物学研究所化学生物学研究平台的3066种化合物进行了筛选，得到3种可以在转录和蛋白水平有效抑制SREBP的化合物。