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【背景】肿瘤的多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象是导致化疗失败的主要因素,也是影响患者生存的主要因素。据统计[1、2],有90%以上的肿瘤患者其化疗失败的原因不同程度地与MDR有关。而TGF-beta/Smads信号传导通路在调节肿瘤多药耐药起到非常重要的双向调节作用:肿瘤发生早期,TGF-beta通过其广泛的多细胞抑制达到肿瘤抑制因子的作用;肿瘤形成后期,则促进肿瘤细胞增殖的。P15,即细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子2B,又称Cdkn2b、INK4B,属INK4蛋白家族,又称多肿瘤抑制基因(MTS1)。P15系TGF-beta/smads信号传导系统下游区的十分重要的细胞生长周期的抑制因子,其表达受到TGF beta的诱导,在TGF beta信号转导通路中主要介导G1期阻滞的作用[3、6]。通过Smad介导的转录和myc所致的生长阻滞的解除,TGF-β可以快速诱导P15在许多不同类型的细胞中的表达[7]。同时TGF-β抑制cdk2激酶活性,提高p15蛋白的表达水平[8]。所以,本课题拟通过调节HepG2/CDDP耐药细胞株中p15蛋白的表达,进而探讨p15与HepG2/CDDP耐药细胞株多药耐药的相关性及其可能的调控作用机制。【目的】⑴检测P15在HepG2/CDDP动态的耐药模型中的表达情况。⑵P15对HepG2耐药细胞的表型的作用;⑶探讨p15介导HepG2/CDDP细胞株多药耐药性变化的可能机制。【方法】⑴采用低浓度逐步递增法,建立HepG2/CDDP动态的耐药模型[9、10、11];⑵将P15编码区片段插入pcDNA3.1以及构建P15正义表达载体,将HepG2耐药细胞分成3组,分别用P15正义表达载体、pcDNA3.1空载体利用脂质体转染到其中2组,另一组为阴性对照组,Western blot验证转染;⑶RT-PCR和Western blot检测P15的表达;⑷流式细胞仪检测HepG2/CDDP耐药细胞株内阿霉素的蓄积和潴留,并以此计算药物的泵出率;⑸流式细胞仪对转染细胞及其对照细胞进行细胞周期分析,并计算细胞的增殖指数(PI);⑹Western blot检测细胞膜药物转运相关蛋白MRP、P-gp蛋白的表达;⑺Western blot检测及细胞凋亡分子BCL-2、Bax的表达。【结果】⑴成功用顺铂诱导HepG2耐药,并建立HepG2/CDDP耐药模型,耐药指数为6.75μg/ml;⑵RT-PCR和Western blot检测P15在2.0μg/ml的CDDP诱导培养HepG2/CDDP耐药细胞24h、48h、3d、5d、7d后,随着HepG2/CDDP耐药细胞株耐药表型的增强,P15表达水平逐渐下降;⑶成功构建p15正义表达载体;稳定转染细胞后建立P15表达升高的细胞系HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15,空载体对照细胞系HepG2/CDDP-pcDNA3.1及亲本细胞HepG2/CDDP,RT-PCR和Western blot验证转染成功,p15正义表达载体可上调P15的表达;⑷HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15细胞内阿霉素的蓄积和潴留增高;⑸HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15细胞增殖指数降低,细胞增殖能力减弱;⑹HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15细胞的MRP、P-gp蛋白的表达下降;⑺HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15细胞的Bcl-2表达下降,Bax表达上升。【结论】1. HepG2/CDDP动态耐药细胞模型建立成功;2. P15随着HepG2/CDDP耐药细胞株耐药表型的增强,其表达水平逐渐下降;3.上调P15表达,可以提高HepG2/CDDP耐药细胞株细胞内化疗药物的蓄积和潴留,促进G1期细胞阻滞,抑制肿瘤细胞增殖,下调MRP、P-gp、bcl-2蛋白,上调bax,进一步可能逆转HepG2/CDDP耐药细胞株的耐药。