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成体干细胞衰老是个体衰老、组织器官衰老及各种衰老相关疾病发生的主要原因。衰老个体中组织器官的功能破坏与成体干细胞数量的减少及功能降低密切相关。作为干细胞研究领域和再生医学领域种子细胞的主要来源,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)随着体外传代培养次数增加,其增殖活性和存活能力降低,多向分化潜能也随之减弱,这是制约患者自体干细胞移植疗效的主要因素之一,也导致了MSCs临床应用的局限性。因此,调控衰老的干细胞“重返青春”以改善衰老相关表型,治疗衰老相关性疾病,是老年医学领域和干细胞研究领域的重大科学问题。本课题组的前期工作发现:衰老MSCs中mi R-34a表达升高,而NAD含量降低,mi R-34a可能通过影响NAD合成促进MSCs衰老。NAD作为细胞能量转化的重要辅酶,能够参与多种代谢途径,如糖代谢。葡萄糖代谢通路的多个步骤都涉及到NAD转化为NADH以及NAD再生。NAD耗竭与细胞衰老及能量代谢紊乱密切相关。有研究显示干细胞的代谢方式以糖酵解为主。mi R-34a与多个糖代谢相关基因如己糖激酶1(HK1)、乳酸脱氢酶(LDHA)等存在潜在的结合位点。由此我们推测,在MSCs衰老过程中,mi R-34a可能通过靶向糖代谢相关基因来影响细胞糖代谢,进而调控干细胞的衰老。本研究以1-2月龄雄性Wistar大鼠为实验动物对象,首先通过全骨髓贴壁法和体外传代培养法获得P2和P10代MSCs,建立体外MSCs复制性衰老模型,然后通过葡萄糖消耗量、乳酸分泌水平、ATP含量和ECAR水平的检测,确定MSCs的主要代谢方式以及衰老细胞糖代谢水平的变化;其次利用RNA seq技术和代谢组学技术对年轻与衰老MSCs进行基因表达差异及代谢产物的检测,筛选出糖代谢相关的差异表达基因,并分析MSCs衰老过程中代谢产物的变化;进一步利用基因过表达技术,探讨mi R-34a对MSCs衰老和细胞糖代谢的影响;最后通过生物信息学预测及双荧光素酶报告基因实验确定HK1为mi R-34a的直接靶基因,并通过RT-q PCR技术检测mi R-34a对HK1表达的影响,探讨HK1对MSCs糖代谢和衰老的调控作用,并通过功能回复实验进一步阐明mi R-34a通过影响细胞糖代谢参与调控MSCs衰老的潜在分子机制。实验结果如下:1、与P2MSCs相比,P10MSCs形态发生明显改变,胞体铺展、边界不清晰,细胞表面积增加而长宽比降低;SA-β-gal染色显示衰老细胞阳性率明显升高,衰老相关因子P16INK4a和Rb1 m RNA的表达显著上调;后续实验以P2MSCs为年轻细胞,P10MSCs为衰老细胞。2、衰老MSCs的葡萄糖消耗量、乳酸分泌水平、ATP含量及ECAR水平明显低于年轻MSCs;2-DG处理后,两组细胞的糖代谢水平均显著降低。3、RNA seq结果显示,与年轻MSCs相比,衰老MSCs中共有2874个基因的表达具有显著差异性,其中包括上调基因868个和下调基因2006个。上调和下调基因的GO和KEGG Pathway富集分析结果显示,组织器官发育和细胞分化等生物进程和通路主要富集于衰老MSCs;而细胞代谢、基础代谢和辅因子代谢等通路在衰老MSCs中明显下调。根据以上分析结果,鉴定筛选出HK1、PFK1和PK等具有显著差异的糖代谢相关基因。4、代谢组学检测结果显示,在衰老MSCs中共有22个代谢产物具有显著差异性。差异代谢产物的Pathway分析结果显示,衰老MSCs中赖氨酸降解和嘌呤代谢等通路显著降低,而不饱和脂肪酸生成通路则明显上调。对RNA seq和代谢组学数据进行关联分析发现,衰老MSCs中的果糖与甘露糖代谢以及糖酵解/糖异生等途径变化显著。5、衰老MSCs中mi R-34a表达明显高于年轻细胞;过表达mi R-34a使年轻MSCs中衰老细胞阳性率显著升高,衰老相关因子表达明显上调;过表达mi R-34a使细胞葡萄糖消耗量和乳酸分泌水平降低,细胞内ATP含量和ECAR水平下降。6、生物信息学预测显示mi R-34a与HK1 m RNA 3’-UTR区存在潜在的互补结合位点;双荧光素酶报告基因实验证实HK1为mi R-34a的直接靶基因;RT-q PCR进一步证实mi R-34a能够调控HK1 m RNA的表达。7、过表达HK1使衰老MSCs的糖代谢水平明显上调;细胞胞体变细变长,立体感增强,衰老细胞阳性率显著降低。8、在年轻MSCs中共表达mi R-34a和HK1,能够上调mi R-34a过表达引起的HK1 m RNA表达下调,并抑制mi R-34a过表达引起的细胞衰老。综上所述,MSCs的代谢方式以糖酵解为主,衰老MSCs中细胞糖代谢水平显著降低;HK1为mi R-34a的直接靶基因,mi R-34a通过靶向HK1影响细胞糖代谢,进而实现其对MSCs衰老的调控。本研究从代谢组学及表观遗传学角度揭示mi R-34a-HK1通过影响细胞糖代谢参与调控干细胞衰老的潜在分子机制,为解决干细胞衰老所致的种子细胞不足问题提供实验依据,也为延缓干细胞衰老、激活衰老的干细胞“重返青春”开辟了新思路。