原发性骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种全身性代谢性骨病,其特征为骨量减少、骨组织微结构破坏、骨骼脆性增加并易发生骨折,其根据病因可分为:绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,POMP)和老年性骨质疏松症(Senile osteoporosis)。绝经后骨质疏松症在原发性骨质疏松症中最为常见,多发生在妇女绝经后5~10年内。根据国际骨质疏松基金会统计,目前全球有2亿骨质疏松患者,占老年人口的60%,绝经后骨质疏松骨折率约为正常人的4倍,是老年女性致残、致死的常见病因。尽管绝经后骨质疏松症的病因主要为雌激素缺乏,但其具体发病机制尚未完全阐明,许多其他危险因素也共同作用于成骨细胞和破骨细胞成熟的不同阶段,导致骨代谢异常,骨量丢失增多。因此,研究绝经后骨质疏松潜在的危险因素和病理分子机制,可能是未来绝经后骨质疏松症以及多因素相关疾病的切入点,这将有利于疾病的早发现、早诊断和早干预。中医基础理论认为骨代谢异常,尤其是骨质疏松症的发病机制与肾虚密切相关。多种补肾方剂可用于骨代谢相关疾病的辅助治疗,且有利于改善症状。研究表明,六味地黄丸作为补肾方剂对绝经后骨质疏松有保护作用,且长期服用未见明显不良反应。目前,关于绝经后骨质疏松经中成药治疗后基因表达变化及其病理分子机制等相关研究报道较少,六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松的分子机制尚未明确,值得深入研究。研究与骨质疏松相关疾病特征,同样有助于揭示骨质疏松的分子机制。研究表明糖尿病(Diabetes Mellitus)和冠状动脉疾病(Coronary artery disease,CAD)均与骨质疏松症具有相关性,三者可能存在相似的病理生理机制。糖尿病和冠状动脉疾病均与遗传和环境密切相关,是威胁人类健康的高发病率、高致死率疾病。我国糖尿病发病率达10.8%,而2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)占糖尿病患者的90%以上,是一种全身代谢性紊乱疾病,其发病机制尚未完全明确。研究表明2型糖尿病和冠状动脉疾病中具有共同的遗传易感性与病理生理危险因素,冠状动脉疾病是2型糖尿病的常见并发症,且2型糖尿病是冠状动脉疾病的独立危险因素,两种疾病相互影响。探讨2型糖尿病与冠状动脉疾病共有的关键调控基因有助于2型糖尿病、冠状动脉疾病及其相关疾病的病理分子机制研究。近年来,生物信息学(Bioinformatics,BIM)作为一门生命科学和计算机科学相结合形成的新兴学科,已广泛应用于医学各个研究领域,成为生物医学发展中不可缺少的研究手段。随着后基因组时代的到来,基于生物信息学的微阵列技术(Microarray,又称基因芯片)和高通量测序技术(High-throughput sequencing,Hi-seq)的发展,对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,有助于更全面地了解疾病及药物作用的复杂生物过程。目前,对外周血的基因表达谱分析已成为研究各种疾病病理和药物作用分子机制的有效手段之一。本研究通过分析微阵列基因表达数据集,探讨绝经后骨质疏松的关键调控基因并进一步研究六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松的关键调控基因;通过高通量转录组测序(RNA-sequencing)筛查骨质疏松相关疾病,2型糖尿病和冠状动脉疾病特有及共有的关键调控基因。通过一系列生物信息学分析方法包括基因本体论数据库(Gene ontology,GO)功能富集分析、京都基因和基因组百科全书数据库(KEGG)富集分析、蛋白质-蛋白质互作关系(Protein-protein interaction,PPI)网络构建及药物靶标和作用通路预测等方法进一步研究关键调控基因的生物学功能,为阐明绝经后骨质疏松、2型糖尿病、及冠状动脉疾病的病理分子机制和六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松的作用机理提供线索。本研究分为三部分:第一部分绝经后骨质疏松症患者基因表达谱分析;第二部分六味地黄丸干预绝经后骨质疏松患者基因表达谱分析;第三部分骨质疏松相关疾病糖尿病和冠状动脉疾病患者基因表达谱分析。第一部分 绝经后骨质疏松症患者基因表达谱分析目的:分析获得调控绝经后骨质疏松症病理分子机制的关键基因,并进一步研究其生物学功能方法:1.检索并下载基因表达数据库(GEO,gene expression omnibus)中与绝经后骨质疏松症相关的微阵列基因表达数据集。2.通过对获取的基因表达数据集进行整合分析,得到绝经后骨质疏松女性与正常绝经女性血液中差异表达基因。3.通过基因本体论数据库(Gene ontology,GO)对获得的差异表达基因分别从生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组分(cellular component,CC)三方面进行功能富集分析;利用京都基因和基因组百科全书数据库(KEGG)进行通路富集分析。4.利用qRT-PCR检测候选差异表达基因在绝经后骨质疏松患者外周血中的表达水平,用以验证本次整合分析的结果。结果:1.通过GEO数据库获取了4个与绝经后骨质疏松相关的微阵列基因表达数据集,分别为GSE100609,GSE56815,GSE13850,GSE7429。2.对获取的基因表达数据集进行整合分析后发现,共计1732个基因在绝经后骨质疏松女性与正常绝经女性血液中的表达具有显著差异(P<0.05)。3.差异表达基因显著富集在依赖DNA的转录调节过程(P=4.31E-22)、细胞质(P=4.14E-108)、蛋白结合功能(P=4.19E-115)和丝裂原激活的蛋白激酶信号通路(P=2.58E-09)中。对候选基因包括ATF2,FBXW7,RDX和RBBP4的qRT-PCR验证结果与整合分析结果一致。小结:1.1732个差异表达基因参与调控绝经后骨质疏松的病理过程。2.丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)及其介导的通路与绝经后骨质疏松的病理分子机制相关。3.ATF2,FBXW7,RDX和RBBP4是绝经后骨质疏松潜在的调控基因和生物标志物。第二部分 六味地黄丸干预绝经后骨质疏松患者基因表达谱分析目的:探讨中药六味地黄丸干预绝经后骨质疏松患者的分子机制并分析预测其靶标和药物作用通路。方法:1.检索并下载GEO中与采用六味地黄丸干预绝经后骨质疏松的微阵列基因表达数据集。2.通过获取的基因表达数据集,分析六味地黄丸干预前后绝经后骨质疏松女性血液中差异表达基因变化。并将这部分差异表达基因与在绝经后骨质疏松女性和正常绝经女性血液中差异表达的基因取交集,获得在两对比组中共同差异表达的基因,用于下一步分析。3.通过基因本体论数据库(Gene ontology,GO)对获得的共同差异表达基因分别从生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组分(cellular component,CC)三方面进行功能富集分析;利用京都基因和基因组百科全书数据库(KEGG)对进行通路富集分析。4.利用生物通用交互数据集库(BioGRID,http://thebiogrid.org/)分析获得与共同差异表达基因产物互作的蛋白质,并构建蛋白质-蛋白质互作关系(Protein-protein interaction,PPI)网络,采用Cytoscape软件实现蛋白质-蛋白质互作关系网络的可视化。5.应用中医药数据库(BATMAN-TCM)对六味地黄丸主要中药成分的靶标基因进行预测。结果:1.GEO数据库获取1个与六味地黄丸干预绝经后骨质疏松症相关的微阵列基因表达数据集(GSE57273)。2.58个共同差异表达基因在绝经后骨质疏松女性正常绝经女性和六味地黄丸干预前后存在显著差异表达,在两组比较中具有相反的表达趋势。3.三个共同差异表达基因包括CSNK2A1,ATF2以及FBXW7的产物为蛋白质-蛋白质互作关系网络的枢纽蛋白。4.中医药数据库(BATMAN-TCM)的分子机理生物信息学分析发现,ATF2,FBXW7和RDX基因为六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松的潜在靶基因,绝经后骨质疏松女性血液中的表达水平显著高于正常女性,六味地黄丸干预后绝经后骨质疏松女性血液中的表达水平显著降低。5.中医药数据库(BATMAN-TCM)数据库预测发现10个六味地黄丸主要中药成分的共同靶标基因(ESR1,FGFR2,MED1,PGR,PRKCB,PTGS1,PTGS2,TRIM24,VDR,and WNT4),其中ESR1,FGFR2,MED1,WNT4,六味地黄丸干预后表达具有显著差异。小结:1.58个共同差异表达基因与六味地黄丸干预绝经后骨质疏松的分子机制相关。POMP患者LWDH干预后43个呈现负调节,15个正调节。2.ATF2,FBXW7和RDX基因为参与六味地黄丸干预绝经后骨质疏松分子调控机制的关键基因。3.六味地黄丸主要中药成分的10个共同靶标基因中,ESR1,FGFR2,MED1,WNT4为六味地黄丸干预治疗绝经后骨质疏松等相关内分泌疾病的潜在调控基因。第三部分 骨质疏松相关疾病糖尿病和冠状动脉疾病基因表达谱分析目的:研究分析骨质疏松主要相关疾病2型糖尿病(T2DM)、冠状动脉疾病(CAD)病变共有的关键调控基因及分子机制,并进一步分析上述2种疾病是否与绝经后骨质疏松存在共有的调控基因。方法:1.2型糖尿病、冠状动脉疾病、同患两病的患者及正常对照组的外周血单核细胞进行转录组测序(RNA-sequencing)。2.通过分析转录组测序数据获取,与正常对照组相比,在2型糖尿病、冠状动脉疾病及同患两病的患者中特有和共有的差异表达基因。3.对获取的差异表达基因,利用基因本体论数据库(Gene ontology,GO)分别从生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组分(cellular component,CC)三方面进行功能富集分析;利用京都基因和基因组百科全书数据库(KEGG)进行通路富集分析。4.利用生物通用交互数据集库(BioGRID,http://thebiogrid.org/)分析获得与冠状动脉疾病和/或2型糖尿病的差异表达基因产物互作的蛋白质,并构建蛋白质-蛋白质互作关系网络,采用Cytoscape软件实现蛋白质-蛋白质互作关系网络的可视化。5.检索并下载基因表达数据库(GEO)中与2型糖尿病和冠状动脉疾病相关的基因表达数据集,进一步验证冠状动脉疾病和/或2型糖尿病中的候选差异表达基因的表达水平。结果:1.191个基因在2型糖尿病、冠状动脉疾病和两病共存条件下均差异表达,这些共同差异表达基因主要参与病毒感染周期、抗凋亡、胰腺发育、先天免疫应答和凝血功能等生物功能和代谢通路。2.2型糖尿病特异性的蛋白质-蛋白质互作关系网络中,TCF4(Degree=169)、SKP1(Degree=164)、UBE2W(Degree=75)为枢纽蛋白。3.冠状动脉疾病特异性的蛋白质-蛋白质互作关系网络中,HIF1A(Degree=124)、SMAD1(Degree=112)和SKIL(Degree=94)为枢纽蛋白。4.通过GSE23561基因表达数据集对候选差异表达基因进行验证,其中HIF1A、SMAD1和SKIL三个基因在冠状动脉疾病中的表达水平均显著高于正常对照,HIF1A在2型糖尿病中显著下调,与本研究结果基本一致。5.在冠状动脉疾病和/或2型糖尿病中差异表达的前15位基因与绝经后骨质疏松中的差异表达基因比对中未发现相同的调控基因。小结:1.191个差异表达基因可能共同参与冠状动脉疾病和2型糖尿病的病理过程。2.TCF4,SKP1以及UBE2W为2型糖尿病发生发展中的关键调控基因。3.三个在冠状动脉疾病中上调的基因HIF1A,SMAD1与SKIL为参与冠状动脉疾病病理分子机制调控的关键基因,具有缺血再灌注保护作用。4.未发现冠状动脉疾病和/或2型糖尿病与绝经后骨质疏松具有共有的调控基因。结论:1.ATF2、RDX、FBXW7和RBBP4基因是绝经后骨质疏松的潜在调控基因和生物标志物。2.58个共同差异表达基因与绝经后骨质疏松的病理分子机制和六味地黄丸干预机制相关,ATF2、RDX和FBXW7为调控六味地黄丸干预绝经后骨质疏松的关键基因。3.六味地黄丸主要中药成分的10个共同靶标基因中,ESR1,FGFR2,MED1,WNT4为干预治疗绝经后骨质疏松等相关内分泌疾病的潜在调控基因。4.TCF4、SKP1与UBE2W为2型糖尿病的关键调控基因;HIF1A、SMAD1与SKIL为冠状动脉疾病的关键调控基因。5.冠状动脉疾病、2型糖尿病、2型糖尿病伴冠状动脉疾病之间存在共有调控基因。