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寻找胚胎干细胞以及胚胎干细胞分化得到的细胞系的特异性标志物一直是干细胞研究领域的热点问题。由于干细胞保持自我更新和分化的信号通路尚未完全阐明,体内分化过程无法在体外培养模型中重现,专一特异的针对胚胎干细胞及其分化细胞系标志物的缺乏等影响了干细胞及其分化细胞系向临床中的应用。细胞与外界通讯以及彼此联系都是依靠信号分子对表面受体的作用,特定的受体的变化正对应特定的细胞系,如果能找出这些特定的受体就能反过来找到相应的细胞系,并能找出对这些受体所代表的信号通路,这对阐明特殊的信号通路,鉴定,分离和纯化特定的细胞系有重要的意义。
本研究通过培养并限定诱导猕猴胚胎干细胞,利用检测胚胎干细胞关键基因OCT4,Nanog,SOX2的表达情况以及碱性磷酸酶(AKP)的检测来鉴定胚胎干细胞的培养状态;并用悬浮培养和RA+B27诱导的方法来定向诱导猕猴胚胎干细胞使其向神经干细胞方向分化。利用免疫荧光检测和RT-PCR检测神经干细胞关键基因Nestin,SOX2,Mushashi-1的表达来鉴定神经干细胞。并通过用差异酶处理法获得相对比较纯的神经干细胞。
利用噬菌体展示库PH.D-12,以及全细胞悬浮筛选的方法。采用反向/正向的筛选策略,来获得猕猴胚胎干细胞诱导得到的神经干细胞特异性的多肽。通过四轮的筛选,5个特异的肽段被筛选出来。生物信息学分析得出这些多肽含有(V-)(P/T)(RFH-)(A/P)(V-) and(M/A)(TP-)同源短序列(motif)。其中HGE多肽是通过全细胞ELISA检测选择的最适合与神经干细胞结合的肽段。与自由多肽的竞争抑制试验证明了多肽与细胞的结合是通过HGE本身的序列来决定的。Genebank的搜索结果指出,在人类以及灵长类的与HGE肽同源的蛋白中,有一段序列与(V-)(P/T)(RFH-)(A/P)(V-)motif重叠,这一段序列可能在HGE多肽与神经干细胞的结合中起作用。
为进一步分析所选多肽与神经干细胞的结合,免疫细胞化学ICC以及免疫荧光检测用于标记和检测展示HGE肽段的噬菌体与细胞表面的结合。鉴于检测的灵敏度,我们利用新型的荧光材料,量子点标记技术与合成的肽段联结,并通过悬浮结合以及3D成像技术观察到多肽与细胞结合的抗原簇。
通过Westernblot实验,我们发现,HGE肽段与神经干细胞表面蛋白通过与48KD与34KD两个位置的蛋白相互作用来进行联结。
本研究为将来的神经干细胞标记,分离,纯化,以及信号通路的研究提供了研究基础。研究中所采用的方法,同样适用于研究其它的特殊种类的细胞。