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【背景】汉滩病毒（hantaan virus,HTNV）属于布尼亚病毒目汉坦病毒科正汉坦病毒属,为基因组分节段的单负链RNA病毒,目前其感染和致病机制尚不完全清楚,尤其是子代病毒释放的过程。成熟且具有感染力的病毒颗粒在细胞内组装后,需要通过出芽的方式释放到细胞外,进一步感染其它细胞,从而扩大感染。多数负链RNA病毒依靠其基质蛋白（matrix protein）提供的活性出芽,并通过其中的一些特定的保守结构域牢固结合宿主内吞体分选转运复合体（Endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）来完成出芽小泡的形成和剪切分离,由于这些结构域在病毒复制周期的晚期起作用,故称其为晚期结构域（late domain）。布尼亚病毒不具有基质蛋白,但糖蛋白单独表达可形成病毒样颗粒（virus like particle,VLP）,表明糖蛋白具有类似基质蛋白的功能。在对不同汉坦病毒糖蛋白HTNV Gn-CT氨基酸序列进行比对后发现,其中均含有一段保守的氨基酸序列Y-R-T-L,与经典的晚期结构域Y-P-x-L较为相似,故我们欲研究该序列在HTNV出芽过程中的作用:通过构建Y-R-T-L序列的突变体,研究该序列对HTNV出芽的影响,同时明确宿主ESCRT是否参与HTNV出芽过程,并进一步筛选与HTNV出芽密切相关的ESCRT分子,研究其在HTNV出芽过程中的作用机制。【目的】本研究欲通过构建Y-R-T-L序列突变体,研究该序列在HTNV出芽过程中的作用,并明确宿主ESCRT是否参与出芽过程以及HTNV出芽的分子机制。【方法与结果】1.HTNV Gn-CT Y-R-T-L序列对VLP释放的影响首先经序列分析发现不同汉坦病毒包膜糖蛋白的胞质尾区含有一段保守的氨基酸序列Y-R-T-L,在此基础上将HTNV Gn-CT在该序列前后分别进行截短,构建三个突变载体GnΔC14、GnΔC27和GnΔC42,以及完全缺失HTNV Gn-CT的ΔGnCT作为对照。同时利用点突变法将615Y-R-T-L618序列中四个氨基酸分别依次突变为丙氨酸,构建四个突变载体GnY615A（A-R-T-L）、GnR616A（Y-A-T-L）、GnT617A（Y-R-A-L）及GnL618A（Y-R-T-A）。构建的载体经行双酶切鉴定和测序验证正确。将上述构建的突变载体分别转染HEK293T细胞,Western-blot分别检测细胞上清及细胞裂解样品中的VLP,对比各组上清及细胞中VLP的量。结果显示615与617位的酪氨酸和苏氨酸突变为丙氨酸后,上清中VLP的量较野生型有明显降低,而618位的亮氨酸突变对上清中VLP的量影响不显著。透射电子显微镜观察转染HTNV Gn-CT突变质粒的细胞内VLP的形态及分布,发现615至617位三个氨基酸突变后VLP在细胞浆内有较明显的聚集;间接免疫荧光染色观察转染HTNV Gn-CT突变质粒的细胞内包膜糖蛋白的分布,615至617位三个氨基酸突变后Gn明显倾向于在细胞中单侧分布,而转染了wt-M的细胞中Gn呈现均匀分布的状态。2.明确参与HTNV出芽的相关宿主ESCRT分子利用生物信息学软件分别设计针对ESCRT关键连接分子ALIX、TSG101、Nedd4及Vps4A的siRNA各三组,Western-bolt验证siRNA效果,挑选出有效siRNA序列包装慢病毒,Western-blot验证显示各慢病毒能有效降低对应分子的表达。使用慢病毒分别降低细胞中ALIX、TSG101、Nedd4及Vps4A表达后再转染HTNV M片段或感染HTNV,透射电子显微镜观察细胞内VLP形态及数量,in-cell Western检测细胞内病毒抗原量,同时间接免疫荧光染色观察细胞内病毒抗原的分布。透射电子显微镜观察发现,ALIX、TSG101、Nedd4或Vps4A表达降低均会导致VLP在胞浆中聚集;In-cell Western及间接免疫荧光染色观察结果显示,ALIX、TSG101、Nedd4及Vps4A任一表达降低均会阻碍HTNV出芽到培养上清中。HTNV分别感染ALIX、TSG101、Nedd4及Vps4A降低表达后的细胞,收集感染后的细胞培养上清再感染新细胞,ELISA检测细胞内病毒的抗原量;同时使用HTNV感染细胞后,再感染慢病毒降低ALIX、TSG101、Nedd4及Vps4A表达,收集感染后的细胞培养上清感染新细胞,ELISA检测细胞内病毒的抗原量。ELISA结果显示,上述任一分子表达降低均会影响HTNV的出芽。3.明确HTNV Gn-CT与宿主ESCRT相互作用介导病毒出芽的机制免疫共沉淀（Co-IP）筛选能与HTNV包膜糖蛋白相互作用的ESCRT关键分子,以Gn特异性抗体为捕捉抗体,再分别使用ALIX、TSG101、Nedd4及Vps4A抗体作为检测抗体进行Co-IP,筛选出了能直接与Gn相互作用的分子ALIX,同时间接免疫荧光染色观察发现Gn与ALIX在细胞中有明显的共定位。同样方法以Gn特异性抗体作为捕捉抗体Co-IP检测HTNV Gn-CT突变体与ALIX相互作用以确定二者相互作用的位置。结果显示HTNV Gn-CT中Y-R-T-L序列的缺失或突变会导致Gn与ALIX相互作用明显降低,表明Gn与ALIX结合的位置位于HTNV Gn-CT的Y-R-T-L序列。在过表达ALIX的情况下,Co-IP检测HTNV Gn-CT突变体与ALIX的相互作用的变化情况,发现在过表达ALIX时各HTNV Gn-CT突变体与ALIX相互作用的强弱仍然与Y-R-T-L序列密切相关。同时在ALIX过表达的细胞中感染HTNV,通过ELISA及Western-blot检测释放到上清中的病毒抗原量;Western-blot检测ALIX过表达时,各HTNV Gn-CT突变体释放到细胞培养上清中VLP量的变化。结果显示ALIX在过表达的情况下对HTNV及HTNV VLP的释放均有一定的增强作用,但对HTNV Gn-CT突变体的增强作用则较弱。【结论】本研究通过对HTNV包膜糖蛋白胞质尾区的突变,发现HTNV Gn-CT615Y-R-T-L618序列在HTNV VLP释放过程中有重要作用,其中617位苏氨酸的突变对释放到培养上清中的VLP量的影响最大。同时还发现ALIX、TSG101、Nedd4及Vps4的表达降低均能限制HTNV的出芽,证明了HTNV的出芽过程需要ESCRT的参与。进一步利用Co-IP筛选出了能与HTNV包膜糖蛋白Gn相互作用的ESCRT组成分子ALIX,且该分子对HTNV出芽的影响是通过Gn-CT中的Y-R-T-L序列来完成。本研究对HTNV出芽的机制进行了一定的阐明,为后续深入研究HTNV复制周期细节及研制抗病毒药物奠定基础。