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小麦是人类的主要食物来源之一,中国是最大的小麦生产国。确保小麦的优质和产量,对人类的生存和发展和维护世界和平具有重要意义。然而,小麦生产受到许多因素的影响,尤其是病虫害。由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum,Fg）引起的小麦赤霉病（Fusarim head blight,FHB）,是世界范围内的一种小麦真菌病害,特别是在中国,造成了巨大的经济损失。在禾谷镰刀菌感染植物的过程中,能够产生的多种真菌毒素,这些在真菌毒素主要残留在小麦种子中。真菌毒素严重影响小麦的品质,在摄入百万分之几或百万万分之几微量摄入,对人畜健康构成危险。小麦赤霉病常发生在温暖潮湿的地区,近年来由于全球变暖,FHB呈现流行病害趋势。自2000年以来,在中国的小麦赤霉病经常达到流行病水平。在过去几年中,中国几个小麦主产区频繁的爆发小麦赤霉病的疫情,这越来越引起人们对FHB控制的担忧。在控制赤霉病的手段中,应用杀菌剂成本高昂,而且对环境不友好。选育抗病品种是迄今为止控制真菌病害的最佳技术。抗病育种常用的方法包括常规选择、标记辅助选择（Marker-assisted selection,MAS）和基因工程。这三种技术都具有一定的随机性。由于小麦中缺乏抗性种质资源,通过常规育种开发抗FHB品种几乎是不可能的。此外,常规育种往往导致小麦农艺重要性状的恢复率较低。MAS是一种快速的作物改良方法,开发一个新品种需要3-5年的时间,而传统的育种和农艺性状的恢复则需要10-15年的时间。但是,MAS育种成本昂贵,并且需要一个复杂和装备精良的实验室和熟练的劳动力作为基础。RNA干扰（RNA interference,RNAi）在控制小麦赤霉病方面具有巨大的潜力,可作为替代方案或与上述育种策略相结合。宿主诱导的基因沉默（Host-induced gene silencing,HIGS）,是通过将病原菌致病基因片段导入宿主植物,来获得抗性植物的方法,为控制作物病害开辟了新的途径。本研究的主要目标,包括鉴定重要的真菌基因、利用这些重要的真菌基因诱导的有效RNAi、培育转基因小麦株系,以及鉴定转基因小麦株系对FHB的抗性和植株的农艺性状。蛋白激酶C（Protein kinase C,Pk C）作为一种引发多种信号互作通路的酶,对禾谷镰刀菌的生长至关重要。在禾谷镰刀菌中构建缺失Pkc的突变体仍未成功。Chs7在禾谷镰刀菌中也被认为是必不可少的基因。Chs7作为分子伴侣参与内质网输出蛋白Chs3。而Chs3则参与几丁质的形成,几丁质是真菌细胞壁的重要组成成分之一。Pkc和Chs7蛋白的二级和三级结构、它们的多重序列比对和系统发育分析也支持了这两个基因对禾谷镰刀菌生长的重要性。本研究的重点是利用Pkc和Ch7基因的特异片段（Gene-specific tags,Gsts）对Y158和X76小麦品种进行转化。Gsts即Pkc RNAi4和Chs7RNAi1,被设计用于在宿主植物内产生发夹RNA（Hairpin RNA,hp RNA）。在玉米泛素（Maize ubiquitin,Ubi-1）启动子和Nos终止子（Nopaline synthase terminator）的控制下,克隆了Gsts的正义和反义片段,并在中间加入了丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate dehydrogenase kinase,（Pdk）内含子。hp RNA被细胞的RNAi机制识别,并经过处理以产生小干扰RNA（Small interfering RNAs,si RNA）。利用标准的生物信息学软件分析,保证了Pkc RNAi4和Chs7RNAi1的无脱靶效应和无细胞毒性。在体内实验中,通过将白粉病孢子人工接种到从Pkc RNAi4和Chs7RNAi1表达hp RNA的转基因株中,也进一步证实了生物信息学预测的结果。通过基因枪把Pk CRNAi4-Chs7RNAi1共转化Y158,得到了转基因株系YP1、YP2和YP3,通过基因枪将X76与Pkc RNAi4-Chs7RNAi1转化,得到了1个转基因株系XP。由农杆菌介导的转化Y158与Pkc RNAi4-Chs7RNAi1,我们得到了1个转基因株系YC,由农杆菌介导的转化X76与Pkc RNAi4-Chs7RNAi1得到3个株系XC1,XC2和XC3。以磷酸甘露糖异构酶（Phosphomannose isomerase,pmi）为选择标记,pmi在T4代从转基因系中丢失。选择具有单拷贝转基因的转基因株系连续种植几代,每一代通过PCR筛选出阳性植株,以获得纯合株系。转基因株系YP3和XP1的苗期抗性为90%,YC1和XC1的苗期具有65%的抗性。YP3和XP的转基因植物的花期抗性为88-90%,YC1和XC1的转基因植物花期与非转基因植株相比具有50%的抗性。这些结果表明,含有Pkc RNAi4-Chs7RNAi1的转基因株系对赤霉病的抗性达到了中抗到高抗水平,但无论是高抗的还是中度抗性的株系,在纯合的转基因后代群体中,至少三代以内抗性都能够稳定遗传。q PCR结果表明,真菌转录本的降低与植株的抗病性提高之间存在很强的相关性。Pk CRNAi4探针杂交检测结果表明,转基因株系中的si RNA大小主要为21 nt和24 nt。所有转基因株系都被发现对DON积累具有很高的抗性。转基因株系和非转基因株系在植物高度、分蘖数、小穗数、生物量等农艺性状上无显著性差异。对转基因株系的综合研究表明,HIGS介导的hp RNA对FHB和病毒性病害的抗性改良具有巨大的商业化潜力。