背景与目的:水蛭始载于《神农本草经》,历代本草均有记载。中医认为水蛭具有破血、逐瘀、通经之功效。近年来,它的医用研究越来越广泛,特别是水蛭中提取的活性物质,具有抗凝血、降血脂、抗肿瘤和保护心脑血管的作用。水蛭含有100多种生物活性物质,有多种药用功能,大部分研究都集中在单一有效成分的分离纯化与应用。为了最大程度保留菲牛蛭的活性成分,本论文以菲牛蛭抗凝活性为指标,研究了抗凝物质的提取方法、冷冻干燥工艺和提取物冻干粉的多种生物活性,同时探究了活体诱导菲牛蛭抗凝物质的方法。方法:1.菲牛蛭抗凝活性物质的提取:采用水提法比较菲牛蛭活体（生长良好健康的活体菲牛蛭于-80℃冷冻保存）、干体（健康的活体菲牛蛭,蒸馏水冲洗,太阳下晾晒吊干）、病死体（养殖过程中病死水蛭立即打捞,清水清洗-80℃冷冻储存）为原料的抗凝活性。2.比较优化抗凝活性成分提取方法:以菲牛蛭活体为材料,以主成分抗凝活性为指标,对匀浆提取（以溶剂倍数、浸提时间和匀浆次数为因素进行正交实验）、热处理（采用30℃、40℃、50℃、60℃和70℃加热处理10min）和粗分离方法（硫酸铵沉淀法、乙醇沉淀法、PEG沉淀法、丙酮联合等电点沉淀法、酶解法和大孔吸附树脂吸附法）的每个步骤进行比较优化后得到含多种活性物质且毒副产物少的产品,中试放大。对该抗凝溶液进行LC-MS/MS质谱鉴定,Blast2GO进行GO注释分析,NCBI中BLAST进行序列比对分析蛋白功能。3.菲牛蛭抗凝物质的冷冻干燥和储存:通过改变保护剂种类、保护剂浓度、预冻时间和装样量来探究冷冻干燥的工艺,并探究菲牛蛭抗凝活性冻干粉的耐温和耐湿稳定性。4.菲牛蛭冻干粉（最佳提取工艺提取后冷冻干燥的抗凝活性粉末）的生物功能:邻苯三酚法和水杨酸法测定冻干粉的抗氧化能力,体外抗凝和体外溶栓测定冻干粉的抗凝血和溶血栓能力,显微镜观察和MTT法测定冻干粉对正常细胞的毒副作用和对肿瘤细胞的抑制作用。5.仿生学法提取菲牛蛭抗凝物质:根据菲牛蛭的饮食习惯配制特异性营养诱导液喂食菲牛蛭,刺激菲牛蛭分泌抗凝活性物质;然后使用催吐剂使其吐出,收集吐出液体,用于抗凝活性物质提取。结果:1.菲牛蛭抗凝活性物质的提取分离:与菲牛蛭活体比较,菲牛蛭干体抗凝活性损失70%,病死体抗凝活性损失40%。正交实验结果表明采用5倍0.9%NaCl,匀浆浸提0.5 h,匀浆提取2次效果最好。热处理结果表明50℃热处理能够有效去除杂蛋白,活性收率为98.5%,比活力为3.41 ATU/mg,纯化倍数为1.224。对六种粗分离方法进行比较,以抗凝活性和蛋白质含量为指标,确定硫酸铵沉淀法和乙醇沉淀为较优的粗分离方法;然后将硫酸铵沉淀和乙醇沉淀联用得到粗提液,抗凝活性收率达到83.2%,比活力为11.71 ATU/mg,纯化倍数为3.434,且去除了腥味和鲜红的色泽;对其进行中试放大实验,该工艺简单可行,适用于工厂化生产。LC-MS/MS质谱鉴定分析结果表明粗提液含有抗凝血、抗氧化和免疫等相关蛋白。该工艺简单,获得的菲牛蛭抗凝溶液不仅抗凝活性高,含有多种功能蛋白,且无腥味,适用于工厂化药物原料生产。2.菲牛蛭抗凝物质的冷冻干燥和储存:结果表明3%甘露醇、4%甘氨酸、3%吐温-80为保护剂,预冻温度为-30℃,预冻时间为4 h,样品厚度为3 cm,干燥温度为-20℃为最佳冷冻工艺。采取此工艺得到的制品,外观为白色,细腻光滑,无颗粒感,水溶性好,剩余活性为85%。冻干粉的稳定性研究结果表明该制品在60℃高温、相对湿度92.5%条件下不稳定,在15天时活性损失20%;在37℃、相对湿度75%条件下没有活性损失,普通塑料密闭小瓶就可以稳定保存。3.菲牛蛭抗凝活性冻干粉具有多种生物活性:抗氧化实验结果表明冻干粉浓度为0-20mg/ml时,对超氧阴离子的清除率从23.1%增长至87.5%,对羟基自由基的清除率从2.3%增长至26.8%。虽然与维生素C比较,有一定的差距,但是也证明冻干粉有一定的抗氧化性。体外抗凝血实验表明在0-20mg/ml浓度范围内,冻干粉对血浆复钙时间（PRT）、凝血酶时间（TT）和凝血酶原时间（TT）均有显著的影响,且呈浓度依赖效应。体外溶栓实验表明在0-20mg/ml浓度范围内,冻干粉对刚刚形成的血栓具有一定的溶解作用,但是对长时间的血栓几乎没有作用。细胞实验结果表明冻干粉对星形胶质细胞（LLB）无影响,可抑制乳腺癌细胞（MCF-7）和胶质瘤细胞（U251）的生长与增殖,且呈浓度依赖效应。4.仿生学法提取菲牛蛭抗凝物质:结果表明采用150 mmol/LNaCl、10 mmol/L复合氨基酸、1 mmol/L葡萄糖和1%的诱食剂配制的特异性诱导液喂食菲牛蛭;8%乙醇复配剂作为催吐剂可促使菲牛蛭吐出抗凝活性物质。结论:1.通过匀浆提取、热处理、硫酸铵沉淀与乙醇沉淀联用工艺可得到抗凝活性高,纯度高,含有抗凝溶栓活性、抗氧化性和抗肿瘤的菲牛蛭抗凝物质。2.菲牛蛭抗凝物质冷冻干燥后抗凝活性损失较少,且稳定性高。3.采用仿生法探究出了菲牛蛭的活体诱导法,不仅减少了杂蛋白,比活力较高,减少分离纯化的步骤;而且一条水蛭可以反复提取数次,可有效提高对菲牛蛭资源的利用率。