背景:随着人口社会老龄化的加剧,机械交通运输行业的飞速发展,骨折延迟愈合、骨折不愈合(骨不连)、脊柱融合失败及骨质疏松症等骨形成障碍性疾病及相关并发症的发病率越来越高,严重影响了人们的生活、学习和工作,成为临床骨科医师的重大难题之一。骨的形成发育是一个复杂的系统的生理调节过程,由多种功能细胞参与,详细了解骨生成的分子信号机制并进行干预调控,不仅能够延缓减轻骨质疏松症的发生,促进骨折愈合,还能够缩短脊柱融合时间,提高脊柱融合率。成骨细胞来源于间质细胞,分泌功能强大,通过骨基质的合成、分泌和矿化,参与骨的形成,是骨生成的主要功能细胞。成骨细胞由间充质干细胞诱导分化而来,其分化时机及分化方向受严格的分子调控,该调控机制是由极其复杂的信号通路分子及其构成的信号通路实现。系统、完整地认识研究间充质干细胞成骨分化的信号转导调控机制,是进一步研究成骨细胞分化的条件,同时也是实现骨组织工程化应用研究的重要基础。成骨细胞是由具有多向分化潜能的间充质干细胞在特定诱导条件下分化而来,经典的Wnt信号通路在间充质干细胞成骨诱导分化中发挥重要作用,在调控骨的生成发育方面扮演主要角色。Wnt信号蛋白作为一类分泌型糖蛋白,主要通过旁分泌/自分泌、内分泌发挥作用。Wnt信号通路活化后抑制胞质中β-连环蛋白(β-catenin)降解,β-catenin在细胞内积累增加。β-catenin属于蛋白质,具有多种功能,如:粘附、基因表达调控等等,在细胞连接处β-catenin与钙粘素相互作用,参与细胞间粘合带的形成;游离的β-catenin则进入细胞核,参与基因的表达调控。研究显示wnt信号通路分泌的糖蛋白对骨骼多种组织的发育起决定性作用。微小RNA(miRNA)种类数量繁多,通常由22(约23-25)个核苷酸构成,属于内源性非编码单链小RNA分子,与靶基因m RNA 3’非翻译区相结合,一方面与胞内蛋白质结合形成RNA沉默核糖核蛋白复合物(RISC),通过序列完全互补的方式特异结合目标m RNA,并将其降解发挥作用;另一方面通过非完全互补结合而抑制蛋白质翻译,从而在转录后水平参与基因的表达调控。目前,在生物体内已克隆到近千种miRNA序列,参与生物体的生长发育、细胞增殖分化、细胞凋亡、炎症反应及肿瘤发生等众多生理病理过程,据推测1/3的人类基因可能受到miRNA的表达调控。越来越多的证据表明miRNAs在翻译后修饰水平参与基因的表达调控,在MSCs向成骨细胞分化的调控机制中发挥不可替代的作用,是目前的研究热点之一。例如:miR-96、miR-124、miR-199a、miR-100、miR-138、miR-204和miR-20a参与成骨细胞分化的相关研究均有报道。miR-101在人类肿瘤细胞中处于静止状态,大量研究表明miR-101在人体多种细胞的代谢过程中发挥根本性作用,尤其是调控细胞增殖与分化。miR-101可能参与MSCs向成骨细胞分化的调控过程,但其具体的分子机制尚未见报道。最近有证据表明EZH2蛋白抑制Wnt基因表达,导致Wnt/β-catenin信号通路失活,阻断MSCs向成骨细胞诱导分化。目的:骨髓间充质干细胞通过体外原代培养获得,动态监测miR-101在间充质干细胞成骨诱导分化中的表达水平变化。利用miR-101抑制剂和模拟物,观察改变miR-101表达水平(高表达/低表达)对MSCs成骨分化的影响,及其对靶基因EZH2水平的影响。通过观察EZH2表达水平改变对miR-101介导的h BMSCs成骨细胞诱导分化的影响及其对Wnt/β–Catenin信号通路活性的影响,进一步揭示miR-101、EZH2及Wnt/β–Catenin信号转导通路之间的相互关系,为阐明miR-101在人骨髓间充质干细胞成骨分化的调控机制中的作用提供新的思路及有力的支持证据。方法:1.检测miR-101在h BMSCs成骨分化中的表达及其作用。从Cyagen生物科技公司购得成人骨髓间充质干细胞进行细胞传代培养,运用q RT-PCR技术动态检测观察miR-101在h BMSCs成骨分化中表达水平的改变;利用慢病毒转染技术干预改变骨髓间充质干细胞中的miR-101表达水平,观察成骨细胞的特异性标记物的表达水平、ALP活性及细胞矿化水平等,验证miR-101在h BMSCs成骨诱导分化中的作用。2.miR-101对EZH2的调节作用。在前期的实验中,我们通过生物信息学预测分析发现miR-101与EZH2基因的3’UTR区存在碱基互补关系;Western blot分析发现高表达水平miR-101能够显著降低EZH2的蛋白水平,提示EZH2可能是miR-101的直接靶基因,miR-101能够抑制EZH2基因的表达。3.EZH2基因调控miR-101介导的成人骨髓间充质干细胞成骨分化。我们通过构建质粒,干扰EZH2在成人骨髓间充质干细胞的表达水平,通过q RT-PCR分析技术检测成骨细胞特异性标记物的(如RUNX2、ALP、OPN和OCN)表达及ALP活性的改变。4.Wnt信号通路在miR-101介导的成人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。通过TOPflash/FOPflash技术检测Wnt信号通路的活性,进一步通过干预miR-101和EZH2的表达水平,观察Wnt信号通路的活性改变。结果:1.miR-101在h BMSCs向成骨细胞诱导分化中表达水平明显升高;2.miR-101促进h BMSCs向成骨细胞分化;3.EZH2作为miR-101的直接靶基因之一,miR-101能够抑制EZH2的表达;4.EZH2参与miR-101介导的h BMSCs成骨细胞诱导分化调控;5.miR-101通过靶基因EZH2,影响Wnt/β–Catenin信号通路的活性,调控h BMSCs向成骨细胞分化。结论:我们的实验结果证明EZH2作为miR-101的直接靶基因,miR-101与EZH23’UTR直接结合,激活下游的Wnt/β-catenin信号通路,促进h BMSCs向成骨细胞的定向分化,进一步为miR-101调控骨髓间充质干细胞成骨分化提供了新的思路,为骨再生障碍性疾病的治疗提供的新的治疗靶点和方向。