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氨基酸是组成生物机体蛋白质的基本成分,是构建细胞、修复组织的基础材料。氨基酸分子结构中含有不对称的碳原子,属于手性分子,有D和L两种构型。组成蛋白质的绝大多数氨基酸(甘氨酸除外),都属L型。而非天然的氨基酸多为外消旋体,D型在体内必须转化为L型才能被有机体吸收利用。因此手性氨基酸的分离分析,在蛋白质的研究、医药、食品、卫生等领域具有重要意义。
氨基酸对映体的分离分析是分析化学研究中的热点和难点之一。文献报道一般采用气相色谱、液相色谱或毛细管电泳法进行拆分,采用前两种分析方法,操作复杂费时,制备的手性色谱柱费用昂贵。毛细管电泳法分离效率高,分析速度快,操作简单,运行成本低,对环境造成的污染小,与其它方法相比,具有独特的优势,是氨基酸一种理想的分离方法。由于绝大多数氨基酸结构简单,没有紫外一可见吸收、不产生荧光,一般需要样品衍生化才能进行光学检测。样品衍生化过程操作费时繁琐,又容易引入新的误差。电化学检测作为一种灵敏度高、选择性好的检测方法在毛细管电泳分离分析中已经得到广泛的应用,其中电导检测法具有通用性,氨基酸无须经过衍生即可检测,操作简单方便。本文采用毛细管电泳一电导检测法分别对异亮氨酸和赖氨酸对映体进行了分离检测,并对其分离机理进行初步探讨。
本论文共包括三个部分,主要内容和方法如下:
第一章
回顾和评述了毛细管电泳的发展历史;介绍了毛细管电泳的基本原理;概述了毛细管电泳各种进样方式和检测方法,特别对电化学检测的各种方法及其最新应用进展进行了详细的介绍;重点介绍了氨基酸对映体的拆分方法及毛细管电泳技术在氨基酸手性分离中的应用和研究进展;并阐述了本课题的研究背景和意义。
第二章
在熔融石英毛细管(50 μmi.d×50 cm)中,以锌盐为手性选择剂,建立了异亮氨酸对映体(DL-Ile)的毛细管区带电泳.电导检测的分析新方法。异亮氨酸无需经过衍生,在2.8 mmol/L,NaOH+0.8 mmol/L,Cit+2.0 mmol/LZn(Ⅱ)(pH=7.30)电泳介质中,异亮氨酸对映体获得良好的基线分离。其检测线性范围为10~100 mg/L,检出限(S/N=3)为3 mg/L。对分离度的影响因素:电泳运行液组成、手性选择剂的浓度等进行了详细的讨论。本实验具有较好的灵敏度及重现性,操作简便,分析成本低,可发展于实际样品的分析应用。
第三章
以铜和L-组氨酸作为配体交换选择剂,与羟丙基甲基纤维素(HPMC)构成二元手性选择体系,在熔融石英毛细管(50μm i.d×50 cm)中,用毛细管区带电泳-电导法成功对未衍生的赖氨酸对映体(DL-Lys)进行分离。在最佳分离条件下:5.5 mmol/LNaOH+0.8 mmol/LCit+2.0 mmol/LCu(Ⅱ)+2.0 mmol/LL-His+6.0mg/L HPMC(pH=6.50),赖氨酸对映体获得良好的基线分离。其检测线性范围为6~80 mg/L,检出限(S/N=3)为2mg/L。对分离度的影响因素:电泳运行液组成和浓度,配体选择剂摩尔比和浓度,HPMC的浓度等进行了详细的讨论。本实验高效简便,分析成本低,可发展于实际样品的分析应用。