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目的先于神经元死亡的进行性轴突退化是阿尔茨海默病等神经退行性疾病重要的病理学特征之一。在伴有轴突进行性退化的AD脑中,Cdc42的水平上调并且与早期的细胞骨架异常共定位,提示Cdc42与轴突之间可能的内在联系。Cdc42调节神经元轴突发生,但其机制尚未阐明。去磷酸化的脑衰蛋白反应调节蛋白-2(CRMP-2)与微管蛋白结合促进微管组装从而促进神经元轴突发生,我们课题组之前的研究发现Cdc42促进神经元轴突发生的同时伴有CRMP-2的Thr514位点的去磷酸化。研究表明,磷酸化CRMP-2-Thr514位点的激酶为糖原合酶激酶-3β(GSK-3β),GSK-3β的Ser9位点的磷酸化使GSK-3β失活并抑制CRMP-2-Thr514位点的磷酸化从而促进神经元轴突发生。然而,到目前为止,GSK-3β是否参与Cdc42调节神经元轴突发生尚不清楚。本研究的研究目的为探讨GSK-3β在Cdc42调节大鼠海马神经元轴突发生中的作用。方法新生1天SD大鼠原代海马神经元,分别转染空载体(pIRES-EGFP)、野生型Cdc42(pIRES-EGFP-Cdc42wt)、Cdc42 活性突变体(pIRES-EGFP-Cdc42F28L)和Cdc42显性负性突变体(pIRES-EGFP-Cdc42N17),培养72h,应用G-LISA Cdc42活性检测试剂盒测定Cdc42的活性,免疫印迹技术检测GSK-3β的丝氨酸9位点(Ser9)的磷酸化水平,应用GSK-3β激酶活性光度法定量检测试剂盒测定GSK-3β的活性;转染Cdc42活性突变体pIRES-EGFP-Cdc42F28L(空载体pIRES-EGFP作为对照)的同时共转染野生型GSK-3β(pcDNA3.1-GSK-3β wt)和GSK-3β活性突变体(pcDNA3.1-GSK-3β S9A),共转染空载体(pcDNA3.1)作为对照,培养72 h,应用GSK-3β激酶活性光度法定量检测试剂盒测定GSK-3β的活性,免疫印迹技术检测脑衰蛋白反应调节蛋白-2(CRMP-2)的苏氨酸514位点(Thr514)的磷酸化(pT514-CRMP-2),应用免疫荧光技术检测神经元轴突(用轴突的标志物Tau-1标记)的数目和长度;进一步,在原代海马神经元中转染Cdc42显性负性突变体pIRES-EGFP-Cdc42N17(空载体pIRES-EGFP作为对照),培养24 h,应用GSK-3β活性抑制剂LiCl、NaCl和PBS(作为溶剂对照)处理48 h,应用GSK-3β激酶活性光度法定量检测试剂盒测定GSK-3β的活性,采用免疫荧光技术检测神经元轴突(用轴突的标志物Tau-1进行标记)的数目和长度。结果原代海马神经元中,转染野生型Cdc42(pIRES-EGFP-Cdc42wt)和Cdc42活性突变体(pIRES-EGFP-Cdc42F28L)均显著增高Cdc42的活性,增高GSK-3β的Ser9位点的磷酸化水平以及显著降低GSK-3β的活性,转染Cdc42显性负性突变体(pIRES-EGFP-Cdc42N17)显著降低Cdc42的活性,降低GSK-3β的Ser9位点的磷酸化水平以及显著增高GSK-3β的活性;共转染野生型GSK-3β(pcDNA3.1-GSK-3βwt)以及 GSK-3β 活性突变体(pcDNA3.1-GSK-3β S9A)显著升高GSK-3β的活性以及抑制Cdc42活性突变体Cdc42F28L诱导的pT514-CRMP-2的降低、神经元轴突数目的增多以及轴突长度的增长;LiCl处理显著降低GSK-3β的活性以及逆转Cdc42显性负性突变体Cdc42N17引起的轴突发生障碍。结论Cdc42调节大鼠海马神经元GSK-3β的Ser9位点的磷酸化和GSK-3β的活性,Cdc42通过抑制GSK-3β促进大鼠海马神经元轴突发生。