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目的:胃癌是世界范围内第五大最常见的恶性肿瘤,在肿瘤相关致死率中位列第三。在过去的几十年中,尽管关于胃癌的诊治已取得了重大进展,但其整体生存率仍然不尽理想。特别是对于确诊时就已发生远处转移的患者,其五年生存率仍低于5%。因此,鉴定出更为有效可行的生物标记物用以改善胃癌的早期诊断仍然至关重要。在表观遗传学领域中,RNA m6A甲基化修饰,作为RNA甲基化修饰中最为常见的一种,逐渐引起了越来越多的关注。m6A甲基化是一个动态可逆且十分复杂的过程,由甲基转移酶、去甲基化酶以及结合蛋白共同参与调控。m6A甲基化修饰水平的异常表达已被证实与多种恶性肿瘤发生发展密切相关。本研究旨在探讨两个去甲基化酶FTO及ALKBH5对于胃癌发生发展的作用及其具体机制研究。研究方法:1.利用TCGA、GSE62254及GSE15459数据库分析m6A调节剂对胃癌预后影响;2.m6A测序结合转录组测序筛选ALKBH5介导的m6A修饰下游靶基因;3.利用qRT-PCR及蛋白免疫印迹技术检测mRNA及蛋白表达;4.转染siRNA瞬时敲减目的基因表达;5.利用过表达质粒对目的基因进行过表达;6.利用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;7.利用细胞-细胞外基质粘附实验检测细胞与细胞外基质粘附能力;8.利用MTT实验和集落形成实验检测细胞增殖能力;9.利用RNA甲基化免疫共沉淀检测m6A甲基化修饰水平;10.利用R软件（V 4.0.0）和Graph Pad Prism 8统计软件进行统计学分析。所有实验结果均重复3次,并以均值±标准差（±s）表示。P<0.05认为有统计学意义。结果:1、m6A去甲基化转移酶FTO高表达患者预后不良。在TCGA数据集中,单因素和多因素Cox分析评估了所有目前已经报道的全部33种m6A调节剂对胃癌总生存的影响。其中,m6A去甲基化转移酶FTO是最为重要的影响胃癌预后的危险因素。2、FTO促进胃癌细胞迁移和侵袭。利用siRNA敲低BGC823和MGC803细胞系中FTO表达水平。Transwell实验证明,敲减FTO表达后,细胞的迁移及侵袭能力均被下调。3、基于FTO表达构建基因加权共表达网络。为明确FTO促进胃癌发展的分子机制,构建了关于FTO表达的基因加权共表达网络。通过聚类分析及相关性分析,筛选到与FTO表达相关性位列第一,呈显著正相关的天青色模块。4、关键模块的功能富集分析。对天青色模块中的基因进行功能富集分析。KEGG富集分析结果揭示排名前10位的通路中存在多个与肿瘤转移相关的,例如“粘着斑”和“ECM-受体相互作用”。同样,GO富集分析也提示天青色模块中的基因与肿瘤发生发展密切相关,例如“细胞-基质粘附”,“细胞连接组织”和“细胞外基质组织”等多个生理过程。此外GSEA富集分析也显示了FTO的高表达与肿瘤转移相关,尤其是“粘着斑”和“ECM-受体相互作用”通路。5、筛选FTO去甲基化作用调控的靶基因。通过VENNY工具我们筛选到同时存在于“粘着斑”和“ECM-受体相互作用”通路中的26个基因。将与FTO的相关性分析排名前五位的基因进行在线预测靶基因m6A甲基化位点后,仅有ITGB1和LAMC1两个基因中可能存在m6A甲基化修饰位点。KM生存分析提示ITGB1和LAMC1高表达患者预后较差。6、FTO通过降低ITGB1甲基化水平上调其表达进而促进胃癌细胞转移。敲低FTO后在mRNA和蛋白水平,ITGB1的表达均呈现显著下降趋势,而LAMC1的表达未受到明显影响。Me RIP-qRT-PCR实验表明,沉默FTO后ITGB1 mRNA的m6A甲基化修饰水平被显著上调。随后,加入小分子m6A抑制剂环亮氨酸处理细胞,结果发现,与未处理组相比,ITGB1的表达无论是mRNA或是蛋白水平均得到上调。而过表达ITGB1后发现可以部分回复由敲低FTO导致的ITGB1 mRNA水平降低,同时也可部分回复由敲低FTO所致的胃癌细胞迁移和侵袭能力降低。7、m6A去甲基化转移酶ALKBH5在胃癌中的表达存在差异。在TCGA、GSE62254及GSE15459数据集中对ALKBH5对胃癌总生存的影响进行了单因素COX分析。结果提示,在TCGA数据集中,ALKBH5是一个胃癌预后的保护性因素（HR=0.61,P=0.026,95%CI:0.39-0.94）;而GSE62254及GSE15459数据集的结果则提示ALKBH5是一个影响胃癌预后的危险性因素（GSE62254:HR=2.3,P=0.045,95%CI:1.3-4.1;GSE15459:HR=1.4,P=0.28,95%CI:0.77-2.50）。8、ALKBH5促进胃癌细胞转移增殖。利用siRNA敲低ALKBH5表达水平,利用质粒过表达ALKBH5水平。Transwell实验、细胞与细胞外基质粘附实验及MTT实验表明敲减ALKBH5后细胞的迁移、侵袭、与细胞外基质的粘附及增殖能力均被抑制;与之相反,过表达ALKBH5后,细胞的迁移、侵袭、与细胞外基质的粘附及增殖能力均得到了增强。9、m6A测序结合转录组测序筛选ALKBH5去甲基化作用调控的下游靶基因。使用沉默ALKBH5及对照组样品行甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量（Me RIP）测序即m6A-seq,同时结合转录组测序分析筛选潜在下游靶基因。m6A-seq组数据观察到m6A经典的保守序列（即RRACH）,且m6A修饰的信号主要富集在3’-UTR和终止密码在附近。沉默ALKBH5表达后,m6A修饰水平发生上调变化的通路中排名第一的是Hippo信号通路。而在RNA-seq组中,按照fold change≥2和P<0.05进行筛选得到了在沉默ALKBH5表达后,mRNA表达水平发生下调的基因有4492个,上调的基因有2409个。我们将Hippo信号通路中富集得到的基因与mRNA表达水平发生下调的基因取交集后得到了mRNA表达水平发生下调的基因为CTGF、AJUBA、FZD4。KM生存分析提示高表达FZD4组的患者较低表达组患者其总生存更短,而CTGF、AJUBA并不具有提示意义。在GSE62254数据集中,FZD4高表达与年龄（P=0.0015）、肿瘤浸润深度（P<0.001）、淋巴结转移（P=0.022）及远处转移（P=0.007）显著相关。相关性分析提示FZD4与ALKBH5的表达呈现正相关（R=0.3153,P<0.0001）。10、ALKBH5通过下调FZD4的m6A修饰水平上调其表达进而促进胃癌转移增殖。敲减ALKBH5表达后,通过qRT-PCR检测发现,FZD4的mRNA水平被显著下调;而在过表达ALKBH5后FZD4的mRNA水平也对应地被上调。通过siRNA瞬时敲低m6A结合蛋白YTHDF2表达,FZD4的表达随着YTHDF2的敲减得到了明显的上调。11、FZD4促进胃癌细胞转移增殖。利用siRNA敲减FZD4表达,通过Transwell实验、细胞与细胞外基质粘附实验及MTT实验表明证明,敲减FZD4后细胞的迁移、侵袭、与细胞外基质的粘附及增殖能力均受到了抑制。结论:1、去甲基化酶FTO是影响胃癌预后的独立危险因素;2、去甲基化酶FTO通过其去甲基化酶活性下调ITGB1 mRNA的m6A甲基化修饰水平,使ITGB1mRNA表达升高,进而促进胃癌转移的发生。3、去甲基化酶ALKBH5是影响胃癌预后的独立危险因素,可促进胃癌增殖转移;4、去甲基化酶ALKBH5通过下调FZD4mRNA的m6A修饰水平,使FZD4 mRNA表达升高,并且抑制了YTHDF2所介导的促进FZD4 mRNA降解,进而促进胃癌发生。