论文部分内容阅读
目的杜兴氏肌营养不良(Duehenne Muscular Dystrophy DMD)是儿童最常见的X连锁隐性遗传致死性神经肌肉系统疾病,约为活产男婴的1/3500,进行性肌萎缩和肌无力,伴腓肠肌假性肥大是其典型的临床特征,血清肌酸磷酸激酶(CPK)明显升高,肌活检显示营养不良性肌病型,预后极差。患者平均2～6岁发病,7～10岁左右即无法行走,多于20岁左右因心肺合并症而死亡,严重影响了青少年男性的健康成长。本病目前尚无有效的治疗方法。DMD患者l/3是新生突变,2/3由遗传而来,因此产前基因检测是降低DMD患者出生及提供遗传咨询的重要措施,对提高人口质量具有十分重要的意义。致病基因dystrophin基因定位于Xp21.l一21.3,全长约为2400kb,是目前已知的人类最大的基因之一,约占整个X染色体长度的1%及整个基因组长度的0.1%,其中79个外显子编码序列总长度仅为14kb,78个内含子为该基因的大部分序列。内含子区具有易脆性,致病基因的断裂点常非随机地发生于内含子区,有92%的缺失断裂点发生在内含子区域,内含子序列在不同地域及民族中存在显著性差异。Dystrophin基因突变类型以缺失最为常见,约占55～65%,主要分布5′端和中央两个缺失热点区;基因重复约占5～10%,其余的突变为点突变或微缺失,通常导致无义突变和移码突变。本研究在确定胎儿性别后,首先利用dystrophin基因内常见18对外显子引物的mPCR方法,检测了缺失型DMD患者,并对其家族胎儿进行相应缺失位点的检测,然后应用dystrophin基因内含子区的5对(CA)n引物,采用STR-PCR方法对非缺失型家族成员进行基因检测及产前基因检测。并且对mPCR引物进行优化组合。本研究旨在建立一种简便、可靠、临床实用性较强的DMD高危家族的基因检测及其产前基因检测方法,为临床DMD高危家族孕妇开展了遗传咨询和产前基因诊断奠定了一定基础。材料与方法材料:1.收集临床病例:收集4例DMD患者均具有典型的临床表现,结合肌电图、血清心肌酶谱及部分肌肉活检而临床确诊;2.样本来源:抽取每名受检者外周静脉血5ml;在3例DMD高危家族的产前基因诊断中,于孕中期取羊水20ml,孕后期采脐血为样本2ml,提取样本DNA。3.引物合成:1对性别决定基因(SYR)引物,dystrophin基因的18对外显子引物和5对(CA)n引物均在NCBI上采用BLAST工具做比对,确定了所有引物准确性。方法:先用SRY引物进行PCR扩增判断胎儿性别,而后采用mPCR方法检测DMD患者:如检测出有外显子缺失的患者,再用单管PCR检测胎儿相应位点,检测男性胎儿是否缺失。对女性胎儿或未检出外显子缺失的男性胎儿,则采用STR-PCR扩增进行家系连锁分析,以检测胎儿的风险,进行DMD的产前基因诊断。建立稳定PCR反应体系:1. SYR引物的PCR反应体系:总体积25ul,含有基因组DNA50ng,dNTP各200umol/ L,引物各0.2umol/L,1xBueffr,Tarq酶用量2u。2. mPCR反应体系:总体积15ul,含有基因组DNA100ng,dNTP各200umol/L,引物各0.2umol/L,1xBueffr,Tarq酶用量3u,引物分四组:A、B、C、D组。3. STR-PCR反应体系:总体积25ul,含有基因组DNA50ng,dNTP各200umol/L,引物各0.2umol/L,1xBueffr,Tarq酶用量2U。性别决定基因(SRY)引物的PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳,18对外显子引物的mPCR扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳,(CA)n引物PCR扩增产物在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,均采用SYRB Green荧光染料,自动凝胶成像系统上观察结果。结果胎儿性别决定基因检测,共检出4例胎儿,其中2例单胎和1例双胎之甲胎为男性,1例双胎之乙胎为女性,胎儿性别基因检测结果均完全与胎儿羊水细胞的核型分析相符,且与胎儿出生后性别完全相同。采用mPCR结合STR-PCR方法对4例DMD患者的高危家族进行产前基因突变类型检测结果表明:4例DMD患者中有2例检测出dystrophin基因外显子的缺失,1例DMD患者为50,51二个外显子缺失,另1例双胎孕妇高危家族中DMD患者检测出43外显子缺失,同时对双胎之男胎进行dystrophin基因43外显子检测,未发现男胎有43外显子缺失。2例缺失型DMD患者的外显子缺失位点主要集中在中央缺失热区(44～52)内,这与以往的研究较为一致。另2例DMD患者的18对外显子引物的mPCR未检测到dystrophin基因外显子的缺失,为非缺失型DMD患者。对3例DMD高危家族(包括2例非缺失型DMD高危家族和1例缺失型DMD双胎高危家族)进行STR-PCR的dystrophin基因检测发现:3例DMD高危家族的4例胎儿均继承了与患者相同的母源致病单体型,除1例双胎之女胎为风险基因携带者外,其余3例男胎均为DMD高危胎儿,3例患者母亲均为杂合型,同时3例家族的其它成员均未检测dystrophin基因内含子缺失,严格遵循了孟德儿遗传规律。结论胎儿性别检测,mPCR方法与STR-PCR方法三者相结合,是dystrophin基因检测及产前基因检测的理想方法,可作为一种快速、有效、适于临床开展的基因检测技术,可有效地为产前基因诊断提供十分重要的信息,指导遗传咨询,尤其是对散发家族是可行的并且显其优越性。