PepT1是草鱼肠道细胞上皮细胞吸收、转运小肽的主要功能单位,主要负责吸收蛋白质降解产物二肽和三肽。高等动物中营养小肽能上调肠道细胞PepT1表达水平进而提高生长性能,但是细菌降解产物胞壁酰二肽（MDP）也能上调肠道中PepT1的表达水平,继而诱发肠道炎症,PepT1对营养小肽的转运促生长功能日趋清楚,但是关于草鱼肠道PepT1介导转运壁酰二肽（MDP）的特征及诱发肠道炎症方面未见报道。因此,本研究以草鱼为研究对象,以腹腔注射MDP为应激源,探讨PepT1介导MDP诱导肠道炎症发生的信号传导途径及其分子机理与调控。从而,为鱼类细菌性肠道炎症发生的调控机制提供新的思路,同时亦为鱼类病害防治提供新的分子治疗靶点。研究分为以下三个部分。第一部分:以MDP为应激源,研究PepT1介导MDP诱发肠道炎症的机制及调控。体重为30±2 g的健康草鱼,腹腔注射MDP、MDP+肌肽、MDP+Ala-Gln,分别于注射后0、3、6、12、24、48、72h随机选取3尾鱼,取肠道提取RNA,用荧光定量PCR的方法检测各基因表达量。同时,另外取两组草鱼分别注射MDP和MDP+抑制剂PDTC（NF-κB专一抑制剂）,研究MDP对NF-κB的调控作用。结果表明:（1）草鱼腹腔注射细菌MDP应激后,肠道内PepT1 m RNA表达量先上升后下降,在24h时达到最高峰,与对照有极显著差异（P<0.01）,经3D结构预测分析,PepT1分子表面的肽结合位点负责与营养二肽或MDP进行结合及应答。荧光定量PCR结果显示,肠道炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8,信号通路相关因子TNF-α、NOD2、RIP2、NF-κB、MKK4、MKK7、MKK6、p38α和p38β都显著升高（P<0.05）;而且NOD2和RIP2表现出先增高后降低的时间依赖特性,NOD2基因在6 h和24 h显著上调（P<0.05）,RIP2基因在6 h、12 h、24 h都显著上调（P<0.05）。（2）当加入NF-κB的抑制剂PDTC干预后,NF-κB和炎症因子的表达量与对照无显著差异（P>0.05）。注射MDP+肌肽后,IL-1β、IL-6、RIP2、NF-κB、JNK、MKK6、p38α和p38β基因表达量与对照相比无显著差异（P>0.05）,而TNF-α、IL-8、NOD2、MKK4和MKK7上升明显,差异显著（P<0.05）。注射MDP+Ala-Gln后,各炎症因子及信号通路各基因表达水平都无显著差异（P>0.05）。第二部分:研究方法同第一部分,只是抑制剂改为JNK通路专用抑制剂,同时构建了信号通路基因真核表达载体,并在HEK293T细胞中采用双荧光素酶法和双杂交的方法检测信号通路蛋白质的相互作用。（1）克隆了草鱼JNK通路中的关键基因MKK4、MKK7和JNK,序列结构特征及进化分析显示MKK4、MKK7和JNK包含有典型的S＿TKc结构域和磷酸化位点,在不同组织和不同发育时期都广泛表达,具有其他物种中相同的功能。（2）注射MDP应激后,肠道内MKK4、MKK7和JNK m RNA表达水平都呈现出时间依赖性,MKK4、MKK7和JNK m RNA在MDP应激后24 h表达水平最高,与对照有极显著差异（P<0.01）,48h～72h恢复到正常水平;通路下游AP-1 m RNA在12h和24 h极显著上调（P<0.01）。当加入肌肽或Ala-Gln时,显著抑制MDP的诱导作用,其MKK4、MKK7和JNK m RNA的表达水平显著低于MDP组（P<0.05）;同时,在JNK抑制剂干预下肠道炎症因子（TNF-α、IL-8、IL-6）表达水平与对照无显著差异（P>0.05）。荧光素酶法结果显示,单独转染MKK4-Flag或MKK7-Flag的细胞中AP-1-Luc的转录激活显著增强（P<0.05）,而单独的JNK-Flag对的Ap-1信号通路无显著影响（P>0.05）。当JNK-Flag与MKK4-Flag或JNK-Flag与MKK7-Flag共转染时,对AP-1信号通路的激活作用显著增强（P<0.05）,表明,JNK蛋白质可与MKK4或MKK7蛋白质直接相互作用发挥其调控功能。第三部分,研究方法同第二部分。（1）克隆了草鱼p38通路中的关键基因MKK6、p38α和p38β,序列结构特征及进化分析显示MKK6、p38α和p38β包含典型的S＿TKc结构域和磷酸化位点,在不同组织和不同发育时期都广泛表达,具有其他物种中相同的功能。（2）MKK6、p38α和p38βMRNA的表达水平对细菌MDP的应激具有较强的时间依赖性,应激后的24h表达水平显著升高（P<0.01）,当加入抑制时SB203580时IL-15和β-防御素的表达量高于PBS组和SB203580组,但显著低于MDP组（P<0.05）,提示p38MAPK信号通路参与了PepT1/MDP诱导的草鱼肠道炎症反应。用MDP和肌肽或Ala-Gln对草鱼进行应激,结果发现MDP能显著提高草鱼p38MAPK途径基因（p38α、p38β和MKK6）和肠道免疫基因（TNF-α、IL-15和β-防御素）的m RNA表达水平（P<0.05）,而MDP+肌肽和MDP+Ala-Gln均能降低其MRNA的表达水平。双荧光素酶法结果表明,单独的p38α和p38β不能激活HEK293T细胞中的AP-1荧光素酶报告子（P>0.05）,p38α或p38β与MKK6共转染细胞可以激活AP-1信号,表明p38α/p38β可能参与MKK6介导的AP-1信号通路。HEK293T细胞双杂交试验表明,p BIND-p38α/p ACT-MKK6或p BIND-p38β/p ACT-MKK6组的相对洗脱酶活性明显高于p ACT/p BIND组和BINDp38α组其他阴性对照组,p38α和p38β可能直接与细胞内的MKK6相互作用,表明p38α/p38β与MKK6相关,参与AP-1信号通路的调控。综上,草鱼肠道PepT1介导转运细菌寡肽（MDP）进入细胞,激活细胞内NOD2,募集RIP2,通过NF-κB和MAPK两条信号途径激活转录因子AP-1,诱导肠道细胞炎性因子（IL-8和MCP-1）表达,从而引起炎症反应。其中MKK4/7-JNK通路及MKK6-p38α/p38β通路是MAPK信号途径中的是两条重要通路,在PepT1介导MDP诱导肠道炎症的调控中发挥重要作用。营养二肽肌肽和Ala-Gln能降低肠道细胞炎症因子的表达水平,有效缓解PepT1介导MDP诱导的草鱼肠道炎症反应。