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多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是两种常见的神经炎性变性疾病,以神经炎症和免疫失衡为共同的病理特征。Rho激酶(Rho kinase,ROCK)是广泛参与多种基本细胞活动的重要信号分子。研究发现,在MS和PD小鼠的中枢神经系统(Central nervous system,CNS)内有ROCK的大量激活。ROCK抑制剂法舒地尔在MS和PD的小鼠模型中表现出有益的治疗效果,可能和其免疫调节和抗炎作用有关。然而,法舒地尔具有半衰期短和抑制效果不佳等缺点,限制其应用。羟基法舒地尔(Hydroxyfasudil,HF)是法舒地尔的活性代谢产物,具有更长的半衰期和更强的抑制效果。因此,本研究试图通过体内和体外两种方式共同探讨HF在MS和PD小鼠模型中的治疗作用及可能的机制。第一部分羟基法舒地尔在体外具有免疫调节、抗炎和抗氧化作用目的:探究HF在体外对细胞活力、T细胞亚群、炎症和氧化应激的影响。方法:将BV2细胞铺于96孔板中,加入不同浓度的HF溶液,继续孵育24 h后MTT法检测细胞活力。另取部分BV2细胞铺于6孔板中随机分为正常对照组、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)组和LPS+HF组,分别加入PBS、LPS(1μg/ml)、LPS(1μg/ml)和HF(15μg/ml)继续培养24 h,细胞行流式细胞分析,对上清液进行细胞因子和氧化应激水平测定。建立8只实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型,按体重均匀分至EAE组和HF组,HF组小鼠于造模后第3天开始腹腔给药HF(40 mg/kg/d),EAE组小鼠给予等量生理盐水,于造模后第9天处死小鼠采集脾单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),流式细胞术了解T细胞的分化情况。结果:HF在低浓度范围内对BV2细胞活力没有影响,当HF浓度达到30μg/ml时细胞活力出现明显下降。HF抑制CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T细胞,诱导CD4+IL-10+和CD4+CD25+细胞,同时增加了MNCs上清液中IL-10和TGF-β的浓度,降低了IFN-γ和IL-17的浓度。HF增加了BV2细胞中CD206+细胞,减少了CD16/32+细胞,同时增加了IL-4、IL-10、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶,减少了TNF-α、IL-6、IL-1β、活性氧、活性氮和丙二醛的浓度。第二部分羟基法舒地尔调节实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的免疫平衡和抑制其炎症反应目的:在本研究中,我们的目的是探索HF对EAE小鼠的治疗潜力和可能的作用机制。方法:制备16只EAE模型小鼠,按体重均匀分至EAE组和HF组,HF组小鼠在造模后的第3天开始腹腔给药HF(40 mg/kg/d),EAE组小鼠给予等量生理盐水,于造模后第28天处死小鼠,采集脊髓标本,行组织病理染色,免疫荧光染色分析小胶质细胞表型,流式细胞术用于T细胞亚群的分析,Western blot分析粘附分子、炎症信号分子和紧密连接蛋白的表达情况,ELISA法检测细胞因子和氧化应激水平。结果:HF延缓了EAE小鼠的临床起病,减轻了临床严重程度及相关的病理损害。HF抑制粘附分子的表达,从而抑制了CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞向小鼠脊髓中的浸润。同时,HF抑制了CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+T细胞,诱导CD4+IL-10+和CD4+CD25+T细胞,从而改变了T细胞平衡。此外,HF增加了小胶质细胞向M2表型的极化,降低CNS炎症细胞因子和氧化产物的水平,促进抗炎细胞因子和抗氧化酶表达。最后,HF可能通过增加紧密连接蛋白的表达来保护血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)。第三部分羟基法舒地尔可通过抗炎和神经保护来改善帕金森病目的:观察HF对PD小鼠的治疗潜力,并探讨其可能的机制。方法:将24只小鼠按体重均匀分至正常对照组、PD组、PD+HF组。PD组和PD+HF组小鼠连续一周腹腔给药MPTP建立模型。PD+HF组小鼠在造模后第8天开始给予HF(40 mg/kg/d)。正常对照组和PD组小鼠注射等量生理盐水。给药一周后行旷场实验和爬竿实验测试小鼠运动功能,免疫荧光检测酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞数量、小胶质细胞TLR-4表达、细胞表型以及星形胶质细胞中营养因子的表达情况。ELISA检测炎症因子的表达。结果:HF能有效改善PD小鼠的运动症状,减轻多巴胺能(Dopaminergic,DA)神经元的缺失。HF抑制炎症反应和小胶质细胞TLR-4的表达,减少了M1型小胶质细胞促进了M2型小胶质细胞,并且增加了星型胶质细胞内神经营养因子的表达。结论:通过我们对HF体内和体外的研究表明,HF具有免疫调节、抗炎、抗氧化和神经营养多重作用。HF对MS和PD的小鼠均具有良好的治疗效果,有可能成为治疗这两种神经炎性变性疾病的候选药物。然而,HF多重作用的具体细胞分子机制,以及它在其他与MS和PD具有相似病理特征的神经炎性变性疾病的治疗效果还有待进一步的探索和阐明。