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肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,易于肝内转移及向肺、骨、肾、脑转移。对广大肝癌患来说,手术切除是最有效的治疗方法,但5年生存率<12%。随着介入治疗的发展,使得化疗药物可以直接作用于肝癌细胞,部分患者的寿命得以延长。然而,有的肝癌患者对化疗不敏感,容易产生耐药,对于这部分患者来说,目前尚缺乏有效的治疗方法。因此,寻求有效的药物来提高化学疗法的效果是目前研究的焦点。人参是我国传统中草药,在肿瘤的治疗方面具有很高的药用价值,人参皂苷(ginsenoside)是其主要药用成分。大量研究表明人参皂甙Rh2可诱导胰腺癌细胞、肝癌细胞和A549肺癌细胞的凋亡。在我们的实验研究中也发现人参皂甙Rh2可抑制HepG2肝癌细胞的增殖并诱导其调亡,且呈浓度和时间依赖。但其具体的作用机制是什么却尚未有文献报道。Wnt信号通路的异常激活同多种恶性肿瘤如结、直肠癌,肝癌,乳腺癌,前列腺癌等有关。β-catenin作为Wnt通路中重要的信号传递因子参与调节细胞的生长和增殖,研究发现肝癌细胞中β-catenin蛋白的表达水平明显高于癌旁组织,同时β-catenin对抗癌药物有抵抗作用。β-catenin在正常组织及癌组织中作为一个重要的分子,它的稳定性依赖于由Axin、APC和GSK-3p构成的降解复合物,β-catenin在细胞内的表达水平主要由GSK-3p去调节。研究发现肝癌细胞中GSK-3p蛋白的表达水平明显低于正常肝组织及癌旁组织,而且低表达的GSK-3p临床病理特征预示着预后不良。故GSK-3p可作为一个潜在抗癌的靶点。我们实验室刘等研究发现TSPG和Rh2可抑制KG1 α细胞增殖诱导细胞凋亡,且发现经TSPG和Rh2作用后,KGla细胞胞核中的β-catenin蛋白明显减少,其表达区域由胞核向胞膜转移。在肝癌细胞中Rh2是否有类似的作用?而过表达β-catenin是否可以削弱Rh2这一的药理作用呢?Rh2使KGla细胞胞核中的β-catenin蛋白减少,这与GSK-3β是否有关?因此,我们假设Rh2抗癌的作用可能是激活了GSK-3β的活性从而降解β-catenin 。我们首先检测Rh2对HepG2细胞的药理作用,然后构建了过表达P-catenin的慢病毒质粒感染HepG2田胞,检验过表达的P-catenin能否削弱Rh2对HepG2细胞的药理作用；再用GSK-3β的抑制剂Bio ((2’Z,3’E)-6-Bromoindirubin-3’-oxime,糖原合酶激酶-3 β抑制剂)来验证Rh2是否激活了G SK-3β;用PCR.CHIP、WB检测β-catenin下游基因的变化,进一步证实Rh2对HepG2细胞的药理作用可能是通过激活了GSK-3β的活性从而降解β-cateni n来实现的。方法第一部分构建pLOV-EFla-MCS-3FLAG-β-catenin’慢病毒去感染HepG2细胞,运用荧光显微镜观察荧光强度,采用FCM检测感染率,用PCR方法检测β-catenin基因表达。第二部分通过CCK-8法检测人参皂苷Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin细胞的作用。采用FCM检测人参皂苷Rh2对HepG2细胞HepG2-β-catenin细胞周期及凋亡的影响；第三部分利用ELISA检测人参皂苷Rh2对Gsk-3p活性的影响,同时我们加入了GSK-3β的抑制Bio；用PCR检测Gsk-3β、β-catenin, CycliD1、Bax、MMP3基因的表达；用CHIP检测Bcl2、CycliD1、Bax. MMP3基因的表达；运用Western Blots检测Gsk-3β、p-catenin、Bcl2、 CycliD1、Bax、MMP3蛋白的表达。第四部分分别用HepG2、HepG2-β-catenin细胞接种到4周龄的Balb/c裸小鼠臀部,荷瘤直径约0.5cm后采用灌胃针灌入Rh2 (20mg/Kg),每天测瘤的直径及小鼠体重,灌胃20天后处死,测瘤的体重、直径,用HE染色观察细胞的形态；用免疫组化检测Gsk-3β、β-catenin. MMP3;利用ELISA检测人参皂苷Rh2对Gsk-3β活性的影响；用PCR检测Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CycliD1、Bax、MMP3基因的表达；用Western Blot检测Gsk-3β、β-catenin蛋白的表达。实验结果1. 用 pLOV-EF 1 a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒去感染HepG2细胞,感染成功的HepG2细胞命名为HepG2-β-catenin。用PCR检测,HepG2-β-catenin P-catenin基因的表达明显高于HepG2组。2.CCK-8结果显示：Rh2在体外能有效抑制HepG2及HepG2-β-catenin细胞增殖,HepG2-β-catenin细胞的Rh2ic50浓度较HepG2细胞高。3.FCM检测细胞周期结果显示：Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞均可使细胞周期阻滞在G0/G1期；HepG2组G0/G1期(61.02+1.48)%,HepG2+Rh2组(64.57+0.65)%HepG2-β-catenin组(52.86+1.46)%,HepG2-β-catenin+Rh2组(58.61±2.01)%。与HepG2组相比,HepG2-p-catenin组细胞的GO/G1期(52.86±1.46)%明显低于HepG2组(61.02±1.48)%,差异有统计学意义(P<0.01)。4.FCM检测细胞凋亡结果显示: Rh2诱导HepG2和HepG2-p-catenin细胞早期凋亡。HepG2组凋亡率(10.01±2.02)%,HepG2+Rh2组凋亡率(17.27±2.77)%, HepG2-β-catenin组凋亡率(5.26±0.50)%HepG2-β-catenin+Rh2组凋亡率(9.02±1.76)%,HepG2-β-catenin+Rh2组凋亡率低于HepG2+Rh2组,差异有统计学意义(P<0.01)。5. ELISA结果显示:Rh2诱导HepG2细胞12、24、48、72h后,Gsk-3p的活性随着时间延长,逐渐升高,在48小时最高,随后其活性开始降低。Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞48小时,与对照组相比,Gsk-3β的活性均增高,而加入Bio后其活性降低。6. PCR、CHIP、WB结果显示： 人参皂苷Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞后,Gsk-3β、Bax基因及蛋白表达增加,而β-catenin、CycliD1、 Bcl2、MMP3基因及蛋白表达水平下调。与HepG2-β-catenin+Rh2组相比,HepG2+Rh2组除Gsk-3β外各基因及蛋白的表达变化更为显著,且差异有统计学意义(P<0.01)。7.构建肝癌动物模型结果显示：HepG2荷瘤组的瘤重(1.6±0.16)g,HepG2+Rh2荷瘤组(1.0±0.13)g; HepG2-β-catenin荷瘤组(1.7±0.19) g, HepG2-β-catenin+Rh2荷瘤组(1.10±0.12) g, HepG2-β-catenin荷瘤组(1.7+0.19)g瘤重大于HepG2荷瘤组(1.6±0.16)g,HepG2-β-catenin+Rh2荷瘤组(1.10±0.12)g瘤重大于HepG2+Rh2荷瘤组(1.0±0.13)g,差异有统计学意义(P<0.01)。8.HE染色结果显示：HepG2荷瘤组和HepG2-β-catenin荷瘤组中细胞核成异型性,占整个细胞比例大,但HepG2-β-catenin荷瘤组更明显。HepG2-p-catenin+Rh2荷瘤组和HepG2+Rh2荷瘤组中细胞胞核固缩,及大量破碎细胞,而HepG2+Rh2荷瘤组细胞胞核固缩及破碎细胞更明显。9.免疫组化结果显示：人参皂苷Rh2诱导HepG2 及 HepG2-β-catenin细胞,Gsk-3β表达增强,β-catenin、MMP3表达降低。HepG2+Rh2组中P-catenin、MMP3表达弱于HepG2-β-catenin+Rh2组,而Gsk-3β表达则无明显差异。10.ELISA结果显示：人参皂苷Rh2诱导HepG2肿瘤及HepG2-β-catenin肿瘤后Gsk-3β的活性均升高。11.PCR结果显示：人参皂苷Rh2诱导HepG2荷瘤组及HepG2-β-catenin荷瘤组后,Gsk-3p、Bax基因增强,β-catenin、CycliD1、 Bcl2、MMP3表达降低。但HepG2+Rh2组中β-catenin、CycliD 1、Bcl2表达弱于HepG2-β-catenin+Rh2组,Bax基因表达增强,而Gsk-3β表达无明显差异。12. Western B lot结果显示：人参皂苷Rh2诱导HepG2荷瘤组及HepG2-β-catenin荷瘤组后,Gsk-3β蛋白增强,β-catenin表达降低。但HepG2+Rh2组中β-catenin表达弱于HepG2-p-catenin+Rh2组,而Gsk-3β表达无明显差异。结论：1.过表达的β-catenin可削弱人参皂苷Rh2对肝癌HepG2细胞的药理作用。2.人参皂苷Rh2通过激活Gsk-3β降解β-catenin,影响下游基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡及抑制其转移。3.体内试验表明,Rh2对肝癌瘤重的抑制作用是通过激活Gsk-3β降解β-catenin而实现的。