研究背景异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）是根治许多血液系统恶性及非恶性疾病、免疫缺陷病、某些遗传代谢性疾病和严重自身免疫性疾病的主要治疗手段之一。脐带血因其独特的优势,如来源丰富、采集方便、能长期冻存、不易受肝炎病毒、巨细胞病毒和EB病毒等感染、HLA配型要求低、查询方便快捷等优点,且免疫原性弱,移植后移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）尤其是慢性 GVHD（cGVHD）发生率低且移植物抗白血病（graft-versus-leukemia,GVL）效应较强,而成为骨髓和外周血外又一重要的allo-HSCT供源。在临床中有学者发现脐血移植（umbilical cord blood transplantation,UCBT）术后患者在中性粒细胞植入前可出现非感染性发热、非药物所致的红斑性皮疹、腹泻和/或黄疸、非心源性肺水肿等一系列临床表现,即植入前免疫反应（pre-immune response,PIR）,亦称为植入前综合征（pre-engraftment syndrome,PES）。研究显示,UCBT术后患者PES发生率约为20%～78%,中位发生时间为7天（范围5-14天）。目前PES的诊断主要依赖临床症状判定,但有些重症PES患者起病急骤,出现PES症状后迅速出现严重腹泻、肺水肿等症状。单纯依赖临床诊断往往容易延迟治疗导致非移植相关死亡（transplant-related mortality,TRM）增加。此外,目前研究报道中针对PES的治疗方法主要是甲基泼尼松龙（methylprednisolone,MP）,但是具体治疗剂量和其他合并用药等尚无一致性共识。既往文献研究及本中心前期回顾性分析研究发现,轻度PES患者造血重建时间较短,UCBT后原发性植入失败率较低。而重度PES患者易迁延至发生重度急性GVHD（aGVHD）,TRM发生率显著增加。而治疗PES的药物MP过量应用则易导致UCBT后植入失败、移植早期感染等并发症发生率增高。因此我们通过单因素及多因素的分析确定了 PES影响180天TRM的两大高危因素:1、PES发生时间早,UCBT后5～6天发生;2、临床症状多,3个或以上临床症状;建立了 UCBT后PES的危险度评分系统,1个高危因素评分为1分,将UCBT后发生PES的患者分为轻度（PES-0）、中度（PES-1）和重度（PES-2）。以期通过对不同危险度分层的PES患者采用不同剂量MP分层干预治疗,从而改善重度PES患者的预后。研究目的本研究分为两个部分即筛选可能预测PES发生及严重程度的生物学标志物和根据PES危险度分级开展前瞻性、开放性、非随机对照临床研究。第一部分:设计开展前瞻性、开放性、非随机对照临床研究。目前PES的治疗方法差异较大,主要以MP治疗为主,但是MP的剂量用法尚无统一共识。因此我们根据此前的研究结果将PES进行危险度分级并依此应用不同剂量MP分层干预治疗,以期及时有效控制PES,并在不影响脐带血植入的情况下进一步改善重度PES患者的预后。第二部分:筛选预测PES发生及严重程度的生物学标志物。目前PES的诊断主要依赖临床症状,有些重症PES患者进展迅速死亡率较高。但是PES诊断尚无特异性实验室检查标准,单纯依赖临床诊断指导治疗往往延误病情影响患者预后。本研究依据前期危险度评分系统,综合运用Luminex蛋白质液相芯片检测技术及流式细胞因子微球检测技术（cytometric bead array,CBA）,筛选分析可能预测PES发生及严重程度的生物学标志物,可望指导临床及早实施干预性治疗。研究方法第一部分:UCBT后PES危险度分级和不同剂量MP分层干预的前瞻性、开放性、非随机对照临床研究（注册号:ChiCTR-ONC-16009013）。2016年9月至2018年12月本移植中心共340例接受UCBT的恶性血液病患者纳入该临床研究。UCBT后如果患者发生PES,根据PES危险度评分系统对患者进行危险度评分,采用MP为基础的干预治疗:轻度PES（PES-0）患者应用MP0.5mg/kg/d干预治疗,中度PES（PES-1）患者应用MP 1mg/kg/d干预治疗,重度PES（PES-2）患者应用MP2mg/kg/d进行干预性治疗。患者经过上述剂量MP治疗后评估,如果3天内PES相关症状仍然进展、治疗5天后症状不缓解,或者7天后症状仅得到部分改善,则加用二线治疗药物抗CD25单克隆抗体（舒莱）（用法用量:12mg/m2,d1,d3,d7,d14;或d1,d4,d8,d15共4次）。如患者症状控制,MP按照每周总量10%逐渐减量。减量过程中如出现症状波动,则根据情况酌情增加MP用量。主要疗效指标为180天TRM,次要疗效指标为中性粒细胞植入率、中性粒细胞植入时间,血小板植入率、血小板植入时间,Ⅱ～Ⅳ度、Ⅲ-Ⅳ度aGVHD累积发生率,1年cGVHD累积发生率,1年累积复发率,1年期总生存率（OS）,1年期无白血病生存率（DFS）,1年期无GVHD无复发生存率（GRFS）。第二部分:UCBT术后PES生物学标志物的筛选及分析。首先,选取4例接受UCBT的恶性血液病患者,其中1例未发生PES,1例为中度PES（PES-1）患者,2例为重度PES（PES-2）患者。脐带血移植当天为0d。留取0d,+3d,+5d,+7d,+10d,+12d血清标本,采用Milliplex多因子检测试剂盒检测干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-1β、IL-1Rα、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1 7A、单核细胞趋化因子（MCP）-1、巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-1α MIP-1 β、肿瘤坏死因子（TNF）-α水平,筛选出PES患者与未发生PES患者具有较大差异的细胞因子。在此基础上,选取15例UCBT后恶性血液病患者,3例患者未发生PES,12例患者发生PES,其中5例为PES-0,4例为PES-1,3例为PES-2。Milliplex多因子检测试剂盒检测不同时间点细胞因子IFN-γ,IL-6,IL-8,IL-10,MCP-1,MIP-1α的水平。最后,应用CBA方法检测63例恶性血液病患者UCBT后不同时间点细胞因子 IFN-y,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,IL-17A,MCP-1,MIP-1α,TNF-α的水平。研究结果:1.第一部分1.1 PES患者的一般资料及移植情况:2016年9月至2018年12月在本移植中心接受UCBT的恶性血液病患者340例纳入分析,男性191例,女性149例,中位年龄20岁（范围0.75-70岁）,中位体重44kg（范围8-95kg）。急性淋巴细胞白血病（ALL）患者116例（34.1%）,急性髓系白血病（AML）患者154例（45.3%）,骨髓增生异常综合征（MDS）患者37例（10.9%）,慢性粒细胞白血病（CML）患者17例（5%）,其它恶性血液病患者16例（4.7%）。所有患者接受单份UCBT,306例（90%）患者应用BU/CY2为主的清髓性预处理,25例（7.4%）患者应用TBI为主的清髓性预处理,9例（2.6%）患者应用减低强度预处理。其中未发生PES患者100例（29.4%）,发生PES患者240例（70.6%）。根据PES危险度评分系统对240例发生PES的患者进行危险度评分,其中轻度（PES-0）152例（63.3%）,中度（PES-1）67 例（27.9%）,重度（PES-2）21 例（8.8%）。所有患者随访至 2019.7.10,中位随访时间534天（范围194-1041天）。1.2 PES发生的高危因素分析:对比分析未发生PES及不同危险度PES患者的一般资料及移植情况发现:重度PES组患者中位年龄14岁（范围1-50岁）,中位体重31kg（范围8-82kg）,均明显低于其他各组患者。性别、疾病类型、移植前疾病状态、预处理方案、预防GVHD方案、回输脐带血的有核细胞数（TNC）、CD34+细胞数、CD3+细胞数、供受者ABO血型及HLA抗原配型情况,各自之间均无统计学差异。1.3主要疗效指标分析:未发生PES患者与发生PES患者180天TRM差异无统计学意义（16.0%vs 1 8.8%,P=0.579）。亚组分析表明,重度PES（PES-2）患者180天TRM为33.3%,稍高于未发生PES（16%）、轻度PES（PES-0）（18.4%）及中度PES（PES-1）（14.9%）组（P=0.236）。与MP分层干预治疗前数据（2000年4月至2012年2月我中心UCBT后发生PES患者92例）比较,180天TRM轻度PES（PES-0）及中度PES（PES-1）患者在MP分层干预前后无统计学差异（PES-0,17.1%vs 18.4%,P=0.84;PES-1,21.9%vs 14.9%,P=0.428）,重度 PES（PES-2）患者MP分层干预治疗后180天TRM明显低于MP分层干预前（33.3%vs 68.4%,P=0.031）。1.4次要疗效指标分析:1.4.1中性粒细胞累积植入率及植入时间:未发生PES患者与发生PES患者42天中性粒细胞累积植入率和中位植入时间无统计学差异（累积植入率:89.0%vs 96.2%,P=0.161;中位植入时间:17天vs 17天,P=0.962）。亚组分析表明,中性粒细胞累积植入率未发生PES组最低（89.0%）,其次为轻度PES（PES-0）组（94.7%）。中度 PES（PES-1）组及重度 PES（PES-2）组分别为 100%和 95.2%,各组间差异有统计学意义（P<0.001）。中位植入时间,未发生PES组为17天,轻度 PES（PES-0）组 1 7 天,中度 PES（PES-1）组15 天,重度 PES（PES-2）20天,各组间差异有统计学意义（P=0.015）。1.4.2血小板累积植入率及植入时间:未发生PES患者与发生PES患者累积植入率无统计学差异（84.2%vs 84.0%,P=0.239）,而中位植入时间未发生PES患者快于发生PES患者（32天vs 37.5天,P=0.024）。亚组分析表明,血小板累积植入率和中位植入时间各组间无统计学差异（P=0.313;P=0.078）。1.4.3 aGVHD的累积发生率:Ⅱ-Ⅳ度及Ⅲ-Ⅳ度aGVHD的累积发生率,PES组均明显高于未发生 PES 组（32.5%vs 18.0%,P=0.009;26.7%vs 1 3.0%,P=0.007）。亚组分析表明,未发生PES组Ⅱ～Ⅳ度及Ⅲ～Ⅳ度aGVHD的累积发生率最低（分别为1 8%及13%）。随着PES严重程度增加,Ⅱ-Ⅳ度及Ⅲ-Ⅳ度aGVHD的累积发生率升高,重度 PES（PES-2）组最高（PES-0 26.3%,21.1%;PES-1 38.8%,32.8%;PES-2 57.1%,47.6%;P<0.001）。1.4.4 1年cGVHD的累积发生率:未发生PES患者与发生PES患者1年cGVHD累积发生率和广泛型cGVHD累积发生率差异无统计学意义（12.0%vs 11.7%和10.0%vs 8.3%,P=0.946和P=0.658）。亚组分析表明,不同危险度PES患者1年cGVHD累积发生率和广泛型cGVHD的累积发生率差异均无统计学意义（PES-09.9%和 6.6%;PES-1 13.4%和 9.0%;PES-2 19.0%和 1 9.0%;P=0.602 和 P=0.282）。1.4.5 1年累积复发率:未发生PES患者与发生PES患者1年累积复发率差异无统计学意义（13.0%vs 8.3%,P=0.239）。亚组分析表明,不同危险度PES患者1年累积复发率均无统计学差异（PES-0 10.5%;PES-1 4.5%;PES-2 4.8%;P=0.245）。与MP分层干预治疗前数据（2000年4月至2012年2月我中心UCBT后发生PES患者92例）比较,1年累积复发率轻度PES（PES-0）及重度PES（PES-2）患者在MP分层干预前后无统计学差异（PES-0,4.9%vs 11.1%,P=0.68;PES-2,5.3%vs 4.8%,P=0.93）,中度PES（PES-1）患者MP分层干预治疗后明显低于MP分层干预前（5.6%vs 1 8.8%,P=0.015）。1.4.6 1年期OS,DFS及GRFS:1年期OS,DFS及GRFS,未发生PES组患者分别为75%,69%及55%,发生PES组为72.9%,67.9%及51.2%,差异均无统计学意义（P>0.05）。亚组分析表明,不同危险度PES患者1年期OS及DFS均无统计学差异（OS:PES-0 73.0%,PES-1 77.6%,PES-257.1%,P=0.225;DFS:PES-0 66.4%,PES-1 74.6%,PES-2 57.1%,P=0.374）。而 1 年期 GRFS 重度 PES（PES-2）患者明显低于中度（PES-1）及轻度PES（PES-0）患者（28.6%vs 50.7%vs 54.6%,P=0.015）。与MP分层干预治疗前数据（2000年4月至2012年2月我中心UCBT后发生PES患者92例）比较,MP分层干预治疗明显提高重度PES（PES-2）患者1年的OS,DFS及GRFS（OS:56.7%vs 21.1%,P=0.021;DFS:56.7%vs 21.1%,P=0.017;GRFS:27.8%vs 5.3%,P=0.035）;明显提高中度 PES（PES-1）患者 1 年的 DFS（72.7%vs 56.2%,P=0.028）;轻度 PES（PES-0）患者干预治疗前后OS,DFS和GRFS无明显统计学差异（OS:70.7%vs 71.9%,P=0.795;DFS:70.7%vs 65.1%,P=0.864;GRFS:48.8%vs 53.4%,P=0.84）。2.第二部分2.1筛选PES患者及未发生PES患者之间表达差异较大的细胞因子:4例患者均诊断为恶性血液病,其中CML 1例,AML 1例,ALL 1例,MDS 1例,男性1例,女性3例,中位年龄16岁（范围9-50岁）。所有患者均接受单份UCBT。预处理方案均为FLU/BU/CY,预防GVHD的方案为CSA+MMF。根据PES的临床诊断标准及危险度评分系统,1例患者未发生PES,3例患者发生PES,其中1例为PES-1,2例为PES-2。Milliplex多因子检测试剂盒检测不同时间点的细胞因子水平,结果表明,发生PES患者与未发生PES患者差异较大的细胞因子是IFN-γ,IL-6,IL-8,IL-10,MCP-1,MIP-1α。2.2 Luminex蛋白质液相芯片平台对筛选出的细胞因子进行进一步验证:选取2016.09～2017.02在本移植中心接受单份UCBT恶性血液病患者15例,其中男性9例,女性6例,中位年龄10岁（范围,9个月-35岁）。ALL 8例,AML 6例,幼年型粒单核细胞白血病（JMML）1例。根据PES的临床诊断标准及危险度评分系统,3例患者未发生PES,12例患者发生PES,其中5例为PES-0,4例为PES-1,3例为PES-2。应用Milliplex多因子检测试剂盒检测不同时间点的细胞因子IFN-y,IL-6,IL-8,IL-10,MCP-1,MIP-1α的水平,结果表明,发生PES患者+5d IL-8水平明显高于未发生PES患者（32.50±13.81 vs.10.76±5.44,P=0.021）;亚组分析结果,PES-0组患者+5d IL-8水平明显高于未发生PES患者（39.63±10.91 vs 10.76±5.44,P=0.048）,+10d和+12d IL-10水平在PES-2组患者明显升高（分别为31 1.44±60.57 和 370.23±136.61,P=0.05和P=0.011）。2.3 CBA方法对筛选出的细胞因子进行进一步验证:选取2017年7月至2020年1月在本移植中心接受单份UCBT的恶性血液病患者63例,男性32例,女性31例,中位年龄16岁（范围1-55岁）,中位体重44kg（范围8-88kg）。ALL 16例（25.4%）,AML 35例（55.5%）,骨髓增生异常综合征（MDS）4例（6.3%）,慢性粒细胞白血病（CML）2例（3.2%）,其它恶性血液病6例（9.6%）。未发生PES患者22例（34.9%）,发生PES患者41例（65.1%）。根据PES危险度评分系统对41例发生PES的患者进行危险度评分,轻度（PES-0）22例（53.6%）,中度（PES-1）13例（31.7%）,重度（PES-2）6例（14.7%）。CBA法检测不同时间点细胞因子的水平。结果表明,移植+5d,发生PES患者IL-6、IL-10水平明显高于未发生PES患者（IL-6,42.98±52.63 vs 15.14±17.03,P=0.010;IL-10,21.82±40.95 vs 3.91±4.01,P=0.015）,而且在PES-2患者中水平最高;移植+7d,发生PES患者IL-2、IL-6、IL-8及IL-10水平明显高于未发生 PES 患者（IL-2,3.27±2.82 vs 1.75±1.51,P=0.002;IL-6,36.78±44.36 vs 15.27±10.19,P=0.017;IL-8,72.12±74.43 vs 15.53±5.55,P=0.025;IL-10,37.8±39.53 vs 6.25±5.92,P=0.000）,同样在 PES-2 患者中水平最高。而移植0d和+7d MIP-1α在发生PES患者中水平明显低于未发生PES患者（0d,6.94±5.09 vs 29.56±38.43,P=0.000;+7d,8.63±8.11 vs20.36±38.20,P=0.001）。研究结论1.该前瞻性临床研究进一步证实了发生PES的患者脐带血植入率较高。我们根据影响PES患者180天TRM的两大高危因素（发生时间早,临床症状多）,首次提出了 UCBT后PES的危险度评分系统。并应有不同剂量MP分层干预治疗,可明显降低重度PES患者的180天TRM,提高OS、DFS和GRFS。2.PES是UCBT后特异性的免疫反应,目前国内外许多移植中心采用的不含ATG的强化清髓性脐血移植方案,PES发生率高达70%以上。通过对细胞因子水平的检测结果表明移植早期IL-6、IL-8及IL-10升高可能预测PES的发生及严重程度,但仍需更多的样本量进一步明确。3.重度PES患者的治疗效果仍然较差,尚需寻找新的特异性标记物指导诊断从而及早实施临床干预治疗以进一步提高生存率,改善UCBT患者预后。