蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化和乙酰化等。蛋白质乙酰化修饰主要发生在赖氨酸残基上,是一种重要的蛋白质翻译后修饰。从1964年首次发现乙酰化修饰以来,在真核生物和原核生物中越来越多的乙酰化蛋白被鉴定到,并且发现乙酰化参与转录调节,细胞代谢等一系列生命活动。原核生物的乙酰化研究主要集中在大肠杆菌和沙门菌,通过抗体免疫富集技术结合高分辨率质谱技术,鉴定到了非常多的乙酰化蛋白。在沙门菌细胞内已发现CobB和Pat分别行使蛋白质去乙酰化和乙酰化作用。此外,细胞代谢物乙酰磷酸(AcP)也可以化学催化方式对蛋白质进行乙酰化修饰,但对底物缺乏专一性。因此,我们希望通过细菌双杂交的方式筛选直接与CobB和Pat相互作用的蛋白,以发现更多的乙酰化修饰蛋白。本研究首先构建了鼠伤寒沙门菌(Salmonella enerica serovar Typhimurium)的基因组DNA文库,然后用细菌双杂交系统,在报告菌株中共转化文库质粒和pUT18-pat或pUT18-cobB,利用蓝白选择筛选与Pat和CobB相互作用的蛋白,然后用Western blot检测筛选到蛋白的乙酰化水平以及是否受Pat/CobB/AcP的调控。实验结果显示,通过细菌双杂交筛选,我们获得了 12个与CobB或Pat有相互作用的蛋白。随后验证了 5个蛋白(Lrp、NrdF、RhaR、1074、FliT),发现除FliT外,其他4个蛋白均存在乙酰化修饰。有意思的是这4个蛋白显示不同的 Pat/CobB/AcP 乙酰化修饰机制。其中 Lrp(leucine-responsiveprotein)是沙门菌的全局性转录调节因子,能够正向调控或负向调控很多基因和操纵子的表达,包括参与氨基酸的代谢和转运,菌毛的合成以及沙门菌的毒力等。为进一步对Lrp的乙酰化修饰功能进行深入研究,我们将Lrp N端HTH结构域“识别螺旋”上的K36突变为Q(模拟乙酰化赖氨酸)或R(模拟去乙酰化赖氨酸),表达纯化后用EMSA(凝胶迁移实验)检测突变体与受Lrp调节的fimZ基因启动子的结合能力。之后通过在△ lrp中回补Lrp的野生型和36位赖氨酸模拟乙酰化的突变体,并用qPCR检测下游基因的表达。Westernblot显示LrpK36受到Pat和AcP的乙酰化修饰。EMSA结果表明Lrp的K36突变后对fimZ启动子的结合能力降低。回补实验表明,LrpK36模拟乙酰化抑制下游基因的表达。综上所述,我们在鼠伤寒沙门菌中共鉴定到12个直接与Pat或CobB有相互作用的蛋白,Lrp的36位赖氨酸残基乙酰化抑制其与下游基因启动子的结合,进而影响下游基因的转录,并且Lrp K36乙酰化修饰受到Pat和AcP调控。