论文部分内容阅读
目的探讨左归丸对庆大霉素诱导耳肾损伤的影响及机制。方法选用8周龄听力正常雄性大鼠48只,体重200±20g,随机分为空白组、模型组、左归丸组、SP600125组,每组12只。适应性饲养1周后。空白组腹腔注射生理盐水,并给予生理盐水灌胃；模型组腹腔注射硫酸庆大霉素,并给予生理盐水灌胃；左归丸组腹腔注射硫酸庆大霉素并给予左归丸灌胃；SP600125组每日腹腔注射硫酸庆大霉素,间隔两小时后腹腔注射SP600125溶液,连续10日,每日根据体重调整剂量。造模前行ABR检测,选取听力正常大鼠造模；在给药后第十一天对大鼠行ABR阈值检测,并留取尿标本检测NAG酶,眼眶取血检测Scr、BUN,留取耳肾组织标本进行病理分析及免疫组化和蛋白免疫印迹检测ASK1/MKK4表达情况,采用SPSS19.0统计软件对结果进行统计分析。结果(1)大鼠BUN、Scr、NAG酶的比较,模型组BUN、Scr、NAG酶与其他三组相比明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；空白组与左归丸组、SP600125组比较,左归丸组、SP600125组明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；左归丸组与SP600125组相比不具有统计学意义(P>0.05)。(2)大鼠听性脑干反应(ABR)阈值比较,造模前各组大鼠ABR阈值正常,无明显差异,具有可比性；模型组ABR阈值与其他三组相比模型组听力下降明显,具有统计学意义(P<0.01)；空白组与左归丸组、SP600125组比较,空白组听力明显优于左归丸组、SP600125组,具有显著统计学意义(P<0.01)；左归丸组与SP600125组相比不具有统计学意义(P>0.05)。(3)肾脏病理切片光镜下观察,空白组大鼠肾小管生理结构基本完整,小管间排列紧密有序；模型组大鼠近曲肾小管上皮细胞明显肿胀、胞浆疏松,可见大面积片状坏死及脱落,部分上皮细胞呈空泡变性,管腔内可见较多的细胞碎片和颗粒管型,间质中有大量的炎性细胞浸润,间质纤维组织增生明显,细胞外基质增多,间质明显增宽。左归丸组、SP600125组病理变化比模型组明显减轻,近曲肾小管上皮细胞轻度肿胀,可见少许上皮细胞坏死脱落,细胞间质可见少量炎性细胞浸润,细胞外基质轻度增多,间质增宽不明显。(4)耳蜗病理切片光镜下观察,空白组中耳蜗毛细胞成三排排列、排列整齐、形态规整,模型组耳蜗毛细胞形态不规整、排列紊乱、大小不一、可见细胞缺失,左归丸组和SP600125组毛细胞排列欠整齐、形态尚整齐。(5) ASK1/MKK4在肾组织中的表达比较运用免疫组织化学法,空白组ASK1/MKK4表达量极少,模型组、左归丸组、SP600125组ASK1表达于肾小管上皮细胞胞浆,呈棕黄色,平均光密度的比较,模型组与其他三组相比,模型组明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；空白组与左归丸组、SP600125组比较,左归丸组、SP600125组明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；左归丸组与SP600125组相比不具有统计学意义(P>0.05)。运用免疫蛋白印迹法,ASK1/MKK4在灰度值上,模型组与其他三组相比,模型组明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；空白组与左归丸组、SP600125组比较,左归丸组、SP600125组灰度值明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；左归丸组与SP600125组相比不具有统计学意义(P>0.05)。(6) ASK1/MKK4在耳蜗组织的表达比较运用免疫组织化学法,观察到ASK1/MKK4主要表达于螺旋神经节细胞的胞浆中,呈棕黄色。空白组胞浆染色浅,模型组胞浆染色深。平均光密度的比较,模型组与其他三组相比,模型组明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；空白组与左归丸组、SP600125组比较,左归丸组、SP600125组平均光密度明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；左归丸组与SP600125组相比不具有统计学意义(P>0.05)。运用免疫印迹法,ASK1/MKK4在灰度值上,模型组与空白组、左归丸组、SP600125组相比,模型组明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；空白组与左归丸组、SP600125组比较,左归丸组、SP600125组灰度值明显升高具有显著统计学意义(P<0.01)；左归丸组与SP600125组相比不具有统计学意义(P>0.05)。(7) ASK1/MKK4在耳肾之间的相关性分析。免疫组化中,ASK1蛋白在耳、肾组织中表达的平均光密度具有相关性,相关系数为0.68,呈正相关,具有显著统计学意义(P<0.01), MKK4蛋白在耳肾组织中的表达具有相关性,相关系数0.76,呈正相关,具有显著统计学意义(P<0.01)；免疫印迹中,ASK1蛋白在耳、肾组织中表达的灰度值也具有相关性,相关系数为0.89,呈正相关,具有显著统计学意义(P<0.01), MKK4蛋白在耳肾组织中的表达具有相关性,相关系数0.73,呈正相关,具有显著统计学意义(P<0.01)。结论1.腹腔注射庆大霉素10天后,大鼠尿NAG酶、BUN、Scr出现明显的上升,大鼠听力也出现不同程度的下降,表明庆大霉素诱导的耳肾损伤模型制作成功。2.左归丸可降低庆大霉素诱导的耳肾损伤模型的ABR阈值、BUN、 Scr、NAG酶,可以改善耳肾功能,在一定程度上保护耳组织和肾脏。3.左归丸可降低庆大霉素诱导的耳肾损伤模型的ASK1/MKK4的表达,提示左归丸降低庆大霉素诱导的耳肾损伤可能是通过抑制ASK1/MKK4的表达,保护耳肾组织。4. ASK1/MKK4蛋白在耳肾组织中的表达有相关性,可以认为ASK1/MKK4可能是中医“肾开窍于耳”的物质基础之一。