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G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是目前已知人类基因组内最大的受体家族,广泛分布于各个组织器官中,并参与调控机体几乎所有的生命活动。GPCRs主要通过G蛋白和arrestins介导细胞内信号转导。其中β-arrestins在受体的脱敏-内化-复敏-再循环过程及G蛋白非依赖的信号转导中起到重要的调控作用。论文第一部分利用核磁探针TMSiPhe研究β-arrestin1的构象变化。在实验室早期研究中,杨帆等人利用基因密码子扩展技术将二氟代酪氨酸插入β-arrestin1上7个磷酸基团结合区域(命名为Site 1～7),通过19F NMR实验发现GPCR C-tail上不同的磷酸化编码形式会引起β-arrestin1磷酸根结合口袋的差异化响应,调控β-arrestin1发生特异性构象变化,进而影响β-arrestin1与下游蛋白的相互作用。然而,β-arrestin1上具体某一个磷酸根结合位点是如何影响β-arrestin1的激活态构型,调控β-arrestin 1下游信号转导?基于Arun K.Shukla等人2013年发表在Nature上的工作,我们合成了一种将V2R pT347去磷酸化的短肽V2Rpp-1,以消除与Site 1的直接作用。通过X-ray晶体衍射、1H NMR及BRET技术,我们解析了 β-arrestin1-V2Rpp-1-Fab30 复合物晶体结构,并发现β-arrestin1-R307TMSiPhe在分别加入V2Rpp-WT和V2Rpp-1刺激后会出现双重激活构象S1/S2,其中V2Rpp-1调控β-arrestin1产生S2激活态构象比例的减少,可能降低β-arrestin1与下游蛋白c-Raf1的相互作用。该结果表明V2R T347的磷酸化可以通过调控β-arrestin1两种激活态构象S1/S2的分布比例进而影响β-arrestin1对c-Raf1的招募能力。论文第二部分希望通过电化学探针DFBQ表征GPCR的构象变化。腺苷受体AR是一类能够结合内源性腺苷并调节血管舒张和炎症的嘌呤能受体家族,参与调节人体包括睡眠、血管生成、免疫等生理过程。由于其在疾病治疗方面的广泛应用,A2AR与激动剂或拮抗剂结合后产生的构象变化一直以来备受关注。目前研究A2AR变构调节机制及构象变化的方法主要包括X-ray晶体衍射、核磁共振光谱和冷冻电镜,而我们希望开发一种价格低廉、操作简单、可实时监测的技术,研究A2AR的动态构象变化。基于David E.Benson等人2001年发表在Science上的蛋白质生物电子界面,我们首次提出了 GPCR电化学传感器的构想,即用直观的电化学信号表征GPCR与配体结合后产生的构象变化情况。其具体设计思路是通过在受体N端构建SH3 Domain融合蛋白,将A2AR定向固定在MWCNTs上,然后在A2AR与配体结合后构象变化较大的区域标记醌类电化学探针DFBQ,并设计该探针的取向面向电极表面。理论上,加入配体刺激后A2AR发生构象变化,标记在A2AR上的电化学探针DFBQ与电极表面的相对位移发生改变,进而引起电化学信号的改变。目前,我们在酵母细胞中成功表达并纯化了A2A-WT/V229C受体,并进行了电化学探针DFBQ标记小分子半胱氨酸及β-arrestin1的预实验,实验结果表明DFBQ探针标记蛋白效率良好。后续的研究计划包括对A2AR进行DFBQ探针标记、A2AR-电极偶联以及在不同配体刺激下的电信号分析等工作。最终建立配体效能→GPCR构象改变程度→电信号响应之间的关系,实现电化学探针在GPCR构象研究以及药物筛选中的应用。