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铜(Cu)是植物生长发育所必需的营养元素之一,当其过量时会对植物造成严重的伤害,同时也是对环境造成严重污染的元素之一。由于铜的氧化还原特性,能够通过Fenton反应产生如O2·-、H2O2和OH·等活性氧(ROS)。甲硫氨酸(Methionine,Met)作为一种含硫氨基酸,构成了蛋白质和多肽,但当细胞内活性氧含量增高时,甲硫氨酸极易被氧化成为甲硫氨酸-R,S-亚砜(Methionine-S,R-Sulfoxide,Met-S,R-SO),是蛋白质失活的重要原因之一。甲硫氨酸亚砜还原酶(Methionine Sulfoxide Reductase,MSR)可以特异性地还原生物体内的MetSO为Met。生物体内MSR主要存在MSRA和MSRB两个类型,分别特异性还原Met-S-SO和Met-R-SO。本实验室前期采用2D-PAGE技术,发现Cu处理可引起水稻甲硫氨酸亚砜还原酶(OsMSR)的表达量显著上调,表明OsMSR可能与水稻耐铜性有关。OsMSRA4.1和OsMSRB5是OsMSR的两种亚型,同属一个蛋白家族。本实验通过RT-PCR技术克隆获得水稻OsMSRA4.1和OsMSRB5基因完整编码区,全长分别为792 bp和411 bp,编码263个和137个氨基酸。序列分析表明,它们在单子叶植物中同源性较高,且高度保守。在基于转录水平的表达模式分析下,这些基因在水稻叶片组织中表达量远高于其他组织,铜和甲基紫精(MV)胁迫会导致它们的表达模式发生变化,能在一定范围被诱导表达。本实验构建2个目的基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合载体,分别在洋葱表皮和水稻原生质体进行瞬时表达,亚细胞定位分析表明OsMSRA4.1和OsMSRB5分别定位在质体和细胞质,其中OsMSRB5还在细胞核中有较高的表达,可以发现细胞区域化分工明显。本实验还纯化了 OsMSRB5重组蛋白,进行了体外酶活力测试,以DTT作为电子供体,我们发现该重组蛋白能够特异性还原Met-R-SO,同时对MetSO的衍生物Dabsyl-MetSO也具有还原能力,说明OsMSRB5不仅对游离态Met-R-SO的底物具有较高的催化活性,而且还可还原蛋白结合态的MetSO。为了研究OsMSRA4.1和OsMSRB5的生理功能,本文以T-DNA插入水稻的缺失突变体为osmsra4.1和osmsra5实验材料,在铜胁迫和MV处理下,比较其与野生型水稻之间的生理差异。结果显示,铜胁迫和MV介导的氧化胁迫均能导致osmsra4.1和osmsrb5体内积累H2O2程度高于野生型。MV和铜胁迫均能导致水稻叶绿素含量下降,且突变体下降程度更深。同时还发现osmsra4.1突变体与野生型相比,地上部和地下部铜含量相当,可能还较低些。在两种胁迫下,突变体的生长状况均较野生型差,根系细胞膜完整性也较低。