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[背景和目的]脑缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,I/R)是脑组织经缺血后,血供恢复,过量的自由基导致的组织内的细胞损伤。减轻脑I/R损伤,对改善脑缺血性疾病患者预后非常重要。脑I/R损伤的确切机制有待进一步深入研究。星形胶质细胞是脑和脊髓中特有的星形神经胶质细胞。星形胶质细胞的功能包括:对形成血脑屏障的内皮细胞的生物支持,向神经组织提供营养,维持细胞外离子平衡,以及对脑损伤后脑和脊髓的修复和瘢痕形成的作用。星形胶质细胞通过缝隙连接相连,形成电耦合胞体与其邻近细胞通过间隙连接对远离原始星形胶质细胞的其他星形胶质细胞的活动产生影响。构成脑缝隙连接的连接蛋白(Connexins,Cxs)能够调控脑内离子和小分子的细胞间扩散。Cx43、Cx30在脑星形胶质细胞中表达量最高,在调节神经系统损伤程度中起到重要作用。大脑主要的兴奋性递质谷氨酸可通过缝隙连接扩散,而高浓度的谷氨酸能够诱导神经元损伤和死亡。缺血/再灌注损伤及其诱导的炎症反应能够激活星形胶质细胞半通道,促进细胞释放钙离子、谷氨酸、炎症因子到细胞外。谷氨酸转运蛋白与谷氨酸相关受体调控谷氨酸的细胞外浓度。Cx30的表达与脑内谷氨酸转运蛋白EAAT1的水平相关,Cx43与EAAT1的关系目前尚未明确。星形胶质细胞间的缝隙连接蛋白受到脑损伤的影响,缝隙连接蛋白可能为病理条件下调节胶质谷氨酸的重要因子。本研究通过体外星形胶质细胞缺血再灌注模型(氧糖剥夺再灌注OGD/R)以及大鼠缺血再灌注模型(中动脉缺血再灌注MCAO/R),考察缺血阶段与再灌注阶段缝隙连接蛋白Cx30、Cx43和谷氨酸转运蛋白EAAT1,细胞活力、神经元生长以及细胞组织内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、活性氧(ROS),胞外谷氨酸的差异变化。探索缝隙连接蛋白、谷氨酸装运蛋白在缺血再灌注损伤中作用及机制。[方法]一、缝隙连接蛋白Cx30/Cx43与谷氨酸转运蛋白EAAT1基于脑缺血再灌注损伤星形胶质细胞模型的作用及机制研究分离新生大鼠星形胶质细胞和神经元,并进行免疫荧光鉴定;建立星形胶质细胞氧糖剥夺再灌注(OGD/R)模型,考察不同处理时间对星形胶质细胞活力的影响;免疫荧光检测OGD/R星形胶质细胞细胞培液处理的神经元以及星形胶质细胞与神经元共培养OGD/R后神经元标志物;实时荧光定量PCR检测了星形胶质细胞OGD/R后连接蛋白Cx30,Cx43和谷氨酸转运蛋白EAAT1的mRNA表达水平;Western blot检测Cx30,Cx43和EAAT1的蛋白表达;免疫荧光进一步检测Cx30和Cx43蛋白的表达和定位;应用试剂盒检测了细胞内氧化应激因子MDA、SOD,CAT和ROS水平以及星形胶质细胞培养液上清中谷氨酸的含量。二、缝隙连接蛋白Cx30/Cx43与谷氨酸转运蛋白EAAT1基于大鼠中动脉缺血再灌注模型的作用及机制研究建立了大鼠中动脉缺血再灌注(MCAO/R)模型;考察缺血和再灌注对大鼠脑组织梗塞体积、脑组织中连接蛋白、谷氨酸转运蛋白以及氧化应激因子和谷氨酸的变化。实时荧光定量PCR检测了 MCAO/R动物脑组织中连接蛋白Cx30,Cx43和谷氨酸转运蛋白EAAT1的mRNA表达水平;Western blot检测Cx30,Cx43和EAAT1的蛋白表达;免疫荧光进一步检测Cx30和Cx43蛋白的表达和定位;试剂盒检测了脑组织内氧化应激因子MDA、SOD,CAT和ROS水平以及谷氨酸的含量。[结果]一、缝隙连接蛋白Cx30/Cx43与谷氨酸转运蛋白EAAT1基于脑缺血再灌注损伤星形胶质细胞模型的作用及机制研究1.大鼠星形胶质细胞的鉴定免疫荧光检测新生SD大鼠皮层星形胶质细胞GFAP蛋白的表达和定位。红色荧光(GFAP阳性)细胞达95%以上,细胞形态,状态良好。2.大鼠神经元鉴定免疫荧光检测新生大鼠皮层神经元Map2蛋白的表达和定位。绿色荧光(Map2阳性)神经元,细胞形态完整,状态良好。3.大鼠星形胶质细胞OGD/R细胞活力测定新生大鼠皮层星形胶质细胞P3经过氧糖剥夺0、2h、4h、8h和12h,再灌注培养12h,24h、48h,CCK8检测细胞活力。细胞活力随氧糖剥夺时间的延长下降,氧糖剥夺12h相比于8h下降趋势不明显;相对活力(与正常条件培养的细胞相比)随再灌注时间的延长而下降,再灌注24h、48h的细胞相对活力与12h相比下降趋于平缓。4.大鼠星形胶质细胞OGD/R对神经元影响新生大鼠星形胶质细胞P2经氧糖剥夺再灌注(OGD/R)后,取培养液上清加入DIV13的神经元培养24h后,免疫荧光检测定位Map2蛋白标示神经元。星形胶质细胞氧糖剥夺8h再灌注12h的细胞培液相比仅氧糖剥夺8h的培液对神经元生长状态、形态的影响更显著。新生大鼠星形胶质细胞P2与神经元(DIV11)共培养经OGD8h,再灌注12h后,免疫荧光检测神经元Map2蛋白表达定位。与星形胶质细胞OGD/R培养液上清处理的神经元结果类似,氧糖剥夺8h再灌注12h的细胞状态较仅氧糖剥夺8h的变化更为显著;5.qPCR检测大鼠星形胶质细胞OGD/R后Cx30,Cx43,EAAT1 mRNA表达结果新生大鼠星形胶质细胞(P3),OGD8h/R12h后qPCR检测基因Cx30,Cx43,EAAT1 mRNA表达水平。与正常条件下培养的细胞相比,氧糖剥夺(OGD)8h的细胞以及再灌注12h的细胞内Cx43和EAAT1 mRNA表达水平显著升高(p<0.05),Cx30差异不显著:尽管氧糖剥夺再灌注(OGD8h/R12h)组细胞Cx43和EAAT1 mRNA表达水平与氧糖剥夺组(OGD8h)相比有上升趋势,但差异不显著(p>0.05)。6.Western blot检测大鼠星形胶质细胞OGD/R后Cx30,Cx43,EAAT1蛋白表达结果新生大鼠星形胶质细胞(P3),OGD8h/R12h后western blot检测Cx30,Cx43,EAAT1蛋白表达水平。与正常条件下培养的细胞相比,氧糖剥夺(OGD)8h的细胞以及再灌注12h的细胞内Cx43和EAAT1蛋白表达水平显著升高(p<0.05),Cx30表达显著降低;氧糖剥夺再灌注(OGD8h/R12h)组细胞Cx43和EAAT1蛋白表达水平与氧糖剥夺组(OGD8h)相比显著升高(p<0.05)。7.免疫荧光检测大鼠星形胶质细胞OGD/R后Cx30和Cx43的表达定位新生大鼠星形胶质细胞(P3),OGD8h/R12h后免疫荧光检测Cx30,Cx43蛋白表达定位。与正常条件下培养的细胞相比,OGD 8h的星形胶质细胞间Cx30表达显著降低,Cx43蛋白表达显著升高;OGD8h/R12h相比OGD 8h处理的细胞Cx30表达显著降低,Cx43蛋白表达显著升高。8.大鼠星形胶质细胞OGD/R后细胞MDA、SOD、CAT、ROS和谷氨酸检测缺血再灌注诱导星形胶质细胞内MDA、ROS含量增加;诱导CAT和SOD活性下降;诱导星形胶质细胞释放谷氨酸量增加;再灌注相比缺血处理对细胞活力和胞内连接蛋白、谷氨酸转运蛋白以及氧化应激因子(MDA,SOD,CAT,ROS)的影响作用更显著。二、缝隙连接蛋白Cx30/Cx43与谷氨酸转运蛋白EAAT1基于大鼠中动脉缺血再灌注模型的作用及机制研究1.大鼠中动脉缺血再灌注(MCAO/R)模型神经行为学评分及TTC染色SD大鼠中动脉缺血(MCAO)2h再灌注(R)12h后,缺血组(MCAO)和缺血再灌注组(MCAO/R)Longa评分显著高于假手术组;MCAO/R组与缺血组差异不显著。TTC染色结果显示,缺血组(MCAO)和缺血再灌注组(MCAO/R)脑组织梗死区面积显著大于假手术组;MCAO/R组脑组织梗死区面积与缺血组差异不显著。2.SD大鼠中动脉缺血再灌注后脑组织Cx30,Cx43,EAAT1 mRNA检测结果SD大鼠经中动脉缺血再灌注(MCAO/R)后,与假手术组动物相比,MCAO2h的动物以及MCAO2h/R12h的动物脑组织中Cx43和EAAT1 mRNA表达水平显著升高(p<0.05),Cx30 显著降低;MCA02h/R12h 组动物脑组织中 Cx43 和 EAAT1 mRNA表达水平显著高于MCAO2h组(p<0.05),Cx30mRNA表达水平显著低于MCAO2h组(p<0.05)。3.SD大鼠中动脉缺血再灌注后脑组织Cx30,Cx43,EAAT1蛋白检测结果SD大鼠经中动脉缺血再灌注(MCAO/R)后,与假手术组动物相比,MCAO2h的动物以及MCAO2h/R12h的动物脑组织中Cx43和EAAT1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Cx30显著降低;MCAO2h/R12h组动物脑组织中Cx43和EAAT1蛋白表达水平显著高于MCAO2h组(p<0.05),Cx30蛋白表达水平显著低于MCAO2h组(p<0.05)。4.免疫荧光检测SD大鼠中动脉缺血再灌注后脑组织Cx30和Cx43的表达定位SD大鼠经中动脉缺血再灌注(MCAO/R)后,取缺血半脑海马组织免疫荧光检测Cx30,Cx43蛋白表达定位。与假手术组相比,MCAO2h的动物以及MCAO2h/R12h的动物脑组织中Cx30表达显著降低,Cx43蛋白表达显著升高;MCAO2h/R12h相比MCAO 2h组动物Cx30表达显著降低,Cx43蛋白表达显著升高。5.SD大鼠中动脉缺血再灌注(MCAO/R)后脑组织MDA、SOD、CAT、ROS和谷氨酸检测MCAO/R诱导动物脑组织内MDA、ROS含量增加,CAT和SOD活性下降;诱导动物脑组织中谷氨酸量增加:再灌注相比缺血处理对动物脑组织中连接蛋白、谷氨酸转运蛋白以及氧化应激因子(MDA,SOD,CAT,ROS)的影响作用更显著。[结论]1.OGD/R能够诱导星形胶质细胞活力下降;诱导星型胶质细胞释放的物质影响神经元生长:抑制和其共培养的神经元生长;2.OGD/R诱导体外星形胶质细胞以及体内动物脑内Cx43和EAAT1的表达上调:诱导Cx30表达下调。3.OGD/R诱导体外星形胶质细胞以及体内动物脑内MDA、ROS增加:诱导CAT和SOD活性下降;诱导谷氨酸增加;4.再灌注相比缺血处理对细胞活力和动物脑内连接蛋白、谷氨酸转运蛋白以及MDA,SOD,CAT,ROS的影响作用更显著;5.脑内星形胶质细胞可能通过连接蛋白、谷氨酸转运蛋白影响谷氨酸,相应氧化应激反应介导了脑缺血再灌注损伤。