论文部分内容阅读
研究目的通过用细胞遗传学、逆转录聚合酶链反应、流式免疫磁珠法等不同方法检测慢性粒细胞白血病BCR-ABL的融合基因，通过对不同方法的对照，探讨流式免疫磁珠法在检测该基因方法学的评价。研究方法1、通过细胞遗传学、逆转录聚合酶链反应、流式免疫磁珠法对同一批K562细胞株进行检测（1）经典的细胞遗传学法：对k562进行快速培养，通过阻止有丝分裂、低渗处理、预固定、固定、离心、滴片等步骤，利用热变性姬姆萨G显带技术进行染色体核型分析，对中期细胞进行分析。（2）逆转录聚合酶链反应：通过对K562细胞株的RNA提取及cDNA的合成，再对产物进行扩增，进而对扩增产物进行分析。（3）流式免疫磁珠法：通过对培养的K562细胞的提取、预处理、溶解蛋白，微球标记、上机等步骤对K562细胞的BCR-ABL融合蛋白株进行检测。2、流式免疫磁珠法在检测BCR-ABL融合基因特异度的评价：对培养的HEL细胞株分别进行细胞遗传学、PCR及流式免疫磁珠法3种不同方法进行检测，以评价其特异度。3、流式免疫磁珠法在检测BCR-ABL融合基因灵敏度检测的评价：将培养后的K562细胞株按不同浓度稀释（100%，10%，1%,0.5%,0.2%，0.05%，0%）稀释后，再对稀释后的K562细胞株分别进行检测，以观察CBA在检测BCR-ABL融合蛋白的灵敏度。结果1、BCR-ABL融合蛋白阴阳性阈值的设定将20名BCR-ABL融合蛋白阴性的白血病患者骨髓标本平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）的平均值±3SD，即83.84±49.8。2、流式免疫磁珠法检测BCR-ABL融合蛋白的灵敏性检测稀释试验结果显示在K562细胞株在正常人外周血单核细胞稀释至1%时，仍呈阳性结果。3、流式免疫磁珠法检测BCR-ABL融合蛋白的特异度的检测对HEL及K562细胞株检测结果显示在对正常人外周血单核细胞、HEL细胞株及K562细胞株检测时，BCR-ABL阳性细胞株K562显示较强的PE荧光信号，而不表达BCR-ABL融合蛋白的外周血单核细胞及HEL细胞株则显示阴性的PE荧光信号。4、选取30份K562细胞分别进行检测，结果显示均具有较好MFI，其中8份检测标本在荧光标记后暗室放置20小时后MFI有所下降，但仍能检测出阳性结果。结论通过流式免疫磁珠法对K562细胞株的BCR-ABL融合蛋白检测结果证实了检测的灵敏度及特异度均较好，具有其准确、简便、快速等优点，为以后临床推广CBA奠定基础。