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实验目的:
探讨TLR7和NF-κB在外阴硬化性苔癣和外阴鳞状细胞癌发生、发展过程中的表达及作用。
实验方法:
一、材料
收集中国医科大学附属第一医院妇科手术病人石蜡组织标本,分别取外阴的正常皮肤组织12例、外阴硬化性苔癣组织20例、外阴鳞状细胞癌组织20例。以上标本均已经过病理科出具病理证实。
二、试剂
兔抗人单克隆抗体TLR7购于北京博奥森,兔抗人单克隆抗体NF-κB65购于Santa Cruz,兔spkit超敏试剂盒购于北京中杉金桥,PBS(Phosphate bufferedsolution,磷酸盐缓冲液),DAB(Diaminobenzidine,3,3-二氨基苯联胺),重铬硫酸,二甲苯,梯度酒精,3%双氧水,正常非免疫动物血清,链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液,生物素标记的第二抗体等。
三、免疫组化检测
采用免疫组化SP法分别检测TLR7和NF-κB65在外阴硬化性苔鲜组织20例、外阴鳞状细胞癌组织20例、取12例外阴正常皮肤组织作对照。
四、结果判定
应用AX70万能显微照相系统(OLYMPUS,日本)进行图像采集,TLR7阳性染色定位于细胞浆,NF-κB阳性染色定位于细胞核、部分细胞浆,细胞染色强度分为:阴性(-)为不着色,弱阳性(+)为淡黄色,阳性(++)为棕黄色,强阳性(+++)为深棕黄色。应用显微图像分析系统Meta Morph(UIC/OLUS.US/JP)进行积分光密度测定,每张切片选取5个不同视野,计算同一张切片的平均光密度值,其代表阳性染色细胞在该组织中的表达水平。
五、统计学分析
利用SPSS11.5统计分析软件,各组计量资料的结果进行t检验。P<0.05表示组间有显著性差异,有统计学意义。
实验结果:
TLR7阳性细胞在正常外阴皮肤中全层均有表达,强度为++~+++,TLR7条带光密度值为0.2793±0.0946;在外阴硬化性苔癣组织中全层或下1/3层表达,强度为+~++,TLR7条带光密度值为0.25379±0.0784;两者相比有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。在外阴鳞状细胞癌中主要在癌巢表达,强度为+++,TLR7条带光密度值为0.27034±0.1391,与外阴正常皮肤相比无显著性差异,无统计学意义(P>0.05)。外阴鳞状细胞癌与外阴硬化性苔癣相比有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。
NF-κB65阳性细胞在正常外阴皮肤表皮中表现为近基底细胞和基底细胞阳性,强度为+~+++,NF-κB65条带光密度值为0.27136±0.0526;在外阴硬化性苔癣组织中表现为全层下1/3阳性,强度为-~+,NF-κB65条带光密度值为0.2476±0.0687;两者相比有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。在外阴鳞状细胞癌组织中主要在癌巢表达,强度为++~+++,NF-κB65条带光密度值为0.327±0.0691,与外阴正常皮肤相比有显著性差异,有统计学意义(P(0.05),外阴鳞状细胞癌与外阴硬化性苔癣相比有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。
结论:
1.TLR7参与正常外阴表皮的免疫应答反应,在外阴硬化性苔癣中TLR7的作用减弱。
2.NF-κB在外阴鳞状细胞癌中高表达,促进肿瘤细胞的增殖,在外阴硬化性苔癣中低表达,提示细胞增殖缓慢。