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农业害虫是造成农作物减产最重要的原因。目前,关于害虫的防治主要采用化学杀虫剂和杂交选育抗性品种。然而,过分使用化学杀虫剂能使害虫不断的产生抗性,使用常规的剂量不能达到有效防治的目的,也对生态环境造成严重的破坏。杂交选育抗性品种具备经济、安全等优点,但因选育周期长,抗虫性不稳定等因素受到了限制。通过植物转基因工程方法获得高效稳定的抗虫品系已成为趋势。因此,在植物中发现一类能够有效抵御害虫的基因很有必要,而蛋白酶抑制剂由于具有有效抑制昆虫消化蛋白酶和改善食物营养质量的能力被作为重要的候选基因。植物Phytocystatins是一类广泛分布于植物、动物及微生物中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。大多数鞘翅目昆虫利用半胱氨酸蛋白酶进行消化,所以Phytocystatins具有抑制鞘翅目昆虫消化蛋白质的能力,而对鳞翅目昆虫无特异性抑制作用。因此鉴定桑树中重要的Phytocystatin基因,通过转基因工程获得对桑天牛(Apriona germari)等昆虫防治有效的桑树新品系具有重要的意义。桑树(Morus alba L)是一类能够分泌乳汁的植物,研究报道,桑树乳汁中的蛋白质及次生代谢物质参与了抵御昆虫摄食的过程。使得除家蚕(Bombyx mori)外,自然界中很多昆虫无法取食桑叶。目前,不同类型蛋白酶抑制剂在其它植物中已得到鉴定。所以鉴定桑树乳汁中重要的Phytocystatin基因,将为我们开发稳定高效的杀虫工具提供新的契机。本研究利用生物信息学方法,从川桑(Morus notabilis)全基因组数据库中鉴定了Phytocystatin基因。利用qRT-PCR分析桑树Phytocystatin基因在川桑和广东桑(Morus atropurpurea)品种粤桑-69851中不同器官间的转录水平变化。分析了这些基因在茉莉酸甲酯、创伤、咬食诱导后表达的变化。采用农杆菌转化洋葱表皮细胞的方法,获取了关键基因MaCPI-1编码蛋白在亚细胞水平的定位信息。利用Western-blotting技术对MaCPI-1基因编码蛋白表达情况进行了确定。本研究所获得研究结果如下：1、桑树Phytocystatin基因的鉴定、克隆及生物信息学分析利用生物信息学的方法,在川桑基因组中鉴定得到6个Phytocystatin基因,分别命名为MnCPI-1、MnCPI-2、MnCPI-3、MnCPI-4、MnCPI-5和MnCPI-6.我们在川桑和粤桑-69851两个桑树品种中均克隆得到了上述6个基因,它们在序列上只存在个别碱基的差异。基因结构分析表明桑树Phytocystatin基因的内含子数目和位置与其他植物中报道的相应基因的结果一致。保守基序分析发现,6个基因编码的蛋白质均含有3个与靶蛋白酶互作的保守基序,说明桑树Phytocystatins是一类高度保守的蛋白。桑树与其它物种共51个Phytocy statins采用NJ法构建系统发生树,该系统发生树可以分为A-C三个类群,桑树的6个基因编码的蛋白在3个类群中都有分布。其中MnCPI-1、MnCPI-2、MnCPI-3分布于A类群,且具有C端延伸的Phytocystatins都聚在该类群中。MnCPI-6与单子叶植物Phytocystatins聚在B类群中。MnCPI-4、MnCPI-5聚在C类群,该类群Phytocystatins全来自于双子叶植物。通过分析发现,具有内含子的Phytocystatin基因都聚在A类群中,而单外显子Phytocystatin基因聚在B、C类群,表明基因结构与系统发生树结果具有一致性。17个具有C端延伸的Phytocystatins构建系统发生树表明MnCPI-1与草莓、苹果等蔷薇科植物Phytocystatins聚在一起,与苹果(Malus×domestica Borkh)和草莓(Fragaria×ananassa Duch)的氨基酸序列一致性分别为75%和70%,重要的保守基序的氨基酸完全一致,暗示它们可能行使相同的功能。多序列比对发现MnCPI-1 C端延伸的氨基酸序列与其它物种的序列具有很高的一致性。通过位点模型分析,包括桑树共10个物种中具有C端延伸的基因在整体进化中没有检测出正选择,暗示桑树的MnCPI-1基因可能进行中性或纯化选择。三维结构预测发现,MnCPI-3、MnCPI-4、MnCPI-5与水稻(Oryza sativa) OC-I三级结构相似。一些桑树Phytocystatins也有独特的结构,如MnCPI-2缺失了N端第一个β折叠片,MnCPI-6在介于第一、二两个β折叠片之间多出两个小折叠片。用plantCARE数据库预测桑树Phytocystatin基因上游启动子转录调控位点。发现这些基因的上游转录调控位点主要包括光响应元件,激素响应元件和胁迫响应元件三类。暗示其在桑树防御病虫害、真菌侵染、抗旱和抗寒等方面具有生物学功能。2、桑树Phytocystatin基因表达分析利用qRT-PCR技术检测桑树Phytocystatin基因在川桑根、茎、花、叶器官及乳汁和粤桑-69851根、茎、叶三个器官的转录表达水平。结果表明,川桑中6个Phytocystatin基因至少在一个器官中有表达,MnCPI-1～MnCPI-4在这5个器官中都有表达,但在表达量上存在差异。MnCPI-5在花中特异性的表达,MnCPI-6在根、茎、花、乳汁中微弱表达,在叶中基本不表达。粤桑-69851中除MaCPI-5,其余5个基因在根、茎、叶也都表达,同样表达量上存在差异。比较川桑相同的器官间转录水平,只有MaCPI-3与川桑MnCPI-3相应器官中的表达模式呈现一致。说明Phytocystatin家族基因在川桑与粤桑-69851两个品种器官间表达模式存在差异。相比于其它物种中Phytocystatin基因器官表达模式,桑树Phytocystatin基因在器官中的表达分布较为广泛。除个别基因存在器官倾向性外,大多数基因在根、茎、花、叶、乳汁中均有表达。利用qRT-PCR技术检测茉莉酸甲酯、创伤、咬食处理下桑树Phytocystatin家族基因在粤桑-69851叶片中的转录水平。除MaCPI-5外,其余5个基因在茉莉酸甲酯、创伤、咬食的诱导下表达量不同程度上调,其中在茉莉酸甲酯处理下基因的上调程度更加明显。3. MaCPI-1亚细胞定位及蛋白水平的表达分析采用农杆菌转化洋葱表皮细胞的方法,对MaCPI-1亚细胞定位分析,发现该蛋白在细胞核及细胞质中均有分布。利用Western-blotting分析,受到茉莉酸甲酯、创伤、咬食处理后MaCPI-1蛋白在粤桑-69851幼苗叶片中的表达模式,结果表明,正常生理条件下MaCPI-1在粤桑-69851叶片能表达,也能响应茉莉酸甲酯、创伤、咬食的诱导。这与其在转录水平的表达模式相一致,暗示MaCPI-1可能具有抑制一些特定昆虫消化蛋白酶的潜能。本研究利用生物信息学方法,从川桑全基因组数据库鉴定到6个phytocystatin基因,信息学分析表明,这些基因在序列、结构、保守基序、三维结构上与其它物种相应的基因比较都存在较高的保守性,暗示其在功能上的一致性。qRT-PCR分析表明phytocystatin基因在不同器官中均表达,但表达量存在差异。上述基因也能不同程度的响应茉莉酸甲酯,创伤,咬食诱导。亚细胞定位和Western-blotting表明MaCPI-1定位于细胞核与细胞质中,并且受上述三种处理的诱导,暗示MaCPI-1具有抑制特定昆虫消化蛋白酶的潜能。本研究首次鉴定了桑树phytocystatin基因,并利用分子生物学技术筛选重要的候选基因,为下一步遗传改良提供基础数据。