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轮状病毒(Rotavirus,RV)广泛流行,给世界养牛业带来了严重的经济损失,也是当前牦牛腹泻的重要原因。牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)的VP6蛋白是主要的结构蛋白和组抗原蛋白,在维持病毒颗粒稳固和病毒复制中发挥重要作用。VP6基因序列是轮状病毒11个基因节段中最保守的,是轮状病毒分子检测和血清学检测的首选靶点;近年的研究显示,基于RV VP6重组蛋白的亚单位疫苗可以对RV感染提供有效的保护。本实验的目的是分离牦牛源RV并克隆表达其VP6基因,为进一步的建立血清学检测方法和研究亚单位疫苗奠定基础,取得了以下成果:1.西藏牦牛源轮状病毒的分离鉴定采用MA-104细胞,从5份采自西藏的牦牛源RV阳性腹泻粪便样本分离得到的2个毒株,命名为Yak RVt-1和Yak RVt-2。2株病毒已分别传代培养到10代,均未出现细胞病变。RT-PCR检测结果证明每一代细胞培养物中RV的存在;同时采用间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)也进一步证实分离到的毒株为牦牛源RV。本实验结果为进一步的牦牛源RV分子特征和疫苗研制奠定了物质基础。2.牦牛源RV VP6蛋白的克隆表达与应用参照GenBank中牛RV VP6序列,采用Primer Prime5.0软件设计引物,以Yak RVt-1的细胞培养物为模板,分段扩增了牦牛源RV的VP6基因,拼接后获得了牦牛源RV的VP6的全基因序列,该基因序列全长为1338bp,与GenBank中牛源RV的VP6同源性在90.6%~95.5%之间,与牛RV NCDV标准株的VP6全基因序列相比,有118个点突变,突变率为12%,产生了较大的变异,导致了该蛋白142个位点的氨基酸发生变化。为了进一步获得重组的RV VP6蛋白,人工合成了Yak RVt-1 VP6基因,与pET-28a载体连接转化至TOP10感受态中,构建了pET28a-VP6的表达质粒后将其转染到Rosetta(DE3)中,实现了重组的牦牛源RV VP6在工程菌中的表达。重组的VP6蛋白以包涵体的形式存在,Western Blot试验表明该重组的VP6蛋白对牦牛源RV阳性血清有良好的免疫原性,为进一步建立基于该蛋白的检测方法和亚单位疫苗研制提供物质基础。重组的牦牛源RV VP6蛋白经过纯化后用来制备兔抗高免血清,以制备的RV高免血清作为一抗、FITC标记的鼠抗兔IgG作为二抗,建立了检测牦牛源RV的IFA方法。该方法检测牦牛源RV的细胞培养物,观察到特异性荧光信号;不与常见的致腹泻的冠状病毒、病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛肠道病毒等发生特异性反应,表明本实验建立的IFA检测方法可以用于牦牛源RV的快速鉴定。