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杨树是世界上中纬度地区广泛栽培的重要用材树种,具有广泛的工业用途,世界上许多国家把发展杨树作为解决 杨树是世界主要的造林和经济树种,格林一号黑杨(G1)是从欧洲黑杨与美洲黑杨的杂交后代中选育出的一个无性系,具有抗逆能力较强?材质好和速生等优点,在我国北方广大地区既可作为绿化树种,又是制作高级纸的主要纸浆原料之一,在工业用材中发挥重要作用? 本研究以 G1 为实验材料,以其叶片为外植体进行再生培养,系统地研究了激素浓度?叶片生理状态?光照条件等诸多因素对叶片再生的影响,建立了黑杨叶片培养诱导不定芽的高频再生体系?在此基础上,分别用携带 BG2 基因和反义磷脂酶 Dγ基因(PLDγ)的根癌农杆菌介导转化叶片,通过对转化方法和条件的探索,建立了黑杨 G1 的遗传转化体系? 研究结果表明,不同激素浓度配比和 pH 值对芽再生有重要影响,最终以在 MS 基本培养基中附加 0.5mg/L 6-BA,0.1mg/L NAA 的分化培养基可以高频诱导不定芽的产生?在叶片远轴面上划三刀,造成伤口,以该面接触培养基,接种在上述分化培养基上?经 15 天光培养后可以看到不定芽开始形成,出现的高峰期在接种后的 20-30 天?通常不定芽成簇状密集生长,散布在叶片的各个部位,但以切口部位较多,芽分化率高达 98%以上?在出现不定芽的部位基本无愈伤组织,或只有很少愈伤形成?待小芽长至 1-2cm,将其从叶片上切下,转到壮苗培养基(MS+0.8mg/L KT+ 0.2mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA)上,令其长大成健壮植株? 在建立黑杨叶片培养诱导芽高频再生体系的基础上,通过抗生素筛选等步骤,建立并优化了农杆菌介导的黑杨 G1 遗传转化体系?大体过程是:将培养至对数生长期的农杆菌 (OD600=0.5) 用等体积的 5%的蔗糖溶液(含一定浓度的表面活性剂)稀释成浸染液,浸染叶片 7 分钟,将浸染之后的叶片外植体置于含上述蔗糖溶液的培养皿中,暗培养 1 天后再转至含液体分化培养基的培养皿中共培养 3 天?用无菌蒸馏水冲洗叶片 3 次,滤纸吸干表面的液体后接种于含 400mg/L Cef 的分化培养基上,最后转到选 1<WP=9>韩琳娜:杨树转 ?-1,3-葡聚糖酶(BG2)及反义磷脂酶 Dγ(PLDγ)基因的研究择培养基(MS+1mg/LKT+0.2 mg/LIBA+0.2 mg/L6-BA +15 mg/L Kan+400mg/L Cef)上培养,筛选抗性苗?对抗性植株进行 PCR 和 PCR-Southern杂交检测,证实β-1,3-葡聚糖酶基因(BG2)已成功地整合进黑杨 G1 核基因组中? 对已证实整合有 BG2 基因的植株进行扩繁培养,用相同的方法再转化反义磷脂酶 PLDγ基因,经 PCR 和 PCR-Southern 杂交检测,证实反义PLDγ基因也已整合进携带有β-1,3-葡聚糖酶基因的黑杨 G1 核基因组中?