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背景及目的:卵巢癌是最为常见的女性生殖系统肿瘤,长期以来其死亡率位居各类妇科肿瘤的首位。化学疗法是治疗卵巢癌的首选手段,而化疗耐药是导致治疗失败的主要原因。紫杉醇作为治疗卵巢癌的一线药物,起到了至关重要的作用,耐药性的产生限制其广泛的临床应用,然而耐药潜在机制仍不明确。目前已有研究报道自噬与化疗药物耐药性息息相关,阐明自噬参与肿瘤对化疗耐药的机制研究是当前热点。Micro RNA通过调节ATGs蛋白影响人类癌症自噬的各个阶段,卵巢癌中mi RNA表达异常促进其发展。我们前期结果表明mi R-152-3p在卵巢癌中表达上调,参与卵巢癌的发生和发展,但其在紫杉醇耐药卵巢癌细胞中的生物学功能和分子机制仍不清楚,它能否通过调控自噬而增强卵巢癌对紫杉醇的敏感性也尚未可知,且mi R-152-3p调控靶基因参与卵巢癌对紫杉醇的耐药性机制研究值得探索。PTEN和ATG4D是自噬的核心蛋白,在自噬体生物发生过程中具有显著的调控功能,能够诱导细胞发生凋亡,mi R-152-3p能否靶向PTEN和ATG4D调节自噬参与紫杉醇卵巢癌耐药的机制研究尚不明确。本文首先通过数据库分析,明确mi R-152-3p与PTEN、ATG4D在紫杉醇敏感卵巢癌细胞（A2780）和紫杉醇耐药卵巢癌细胞（A2780T）中的关系;探讨A2780细胞与A2780T细胞中mi R-152-3p的差异表达,并研究mi R-152-3p在卵巢癌中的生物学作用,明确mi R-152-3p通过PTEN调节自噬以降低卵巢癌对紫杉醇的耐药性,从而为卵巢癌的临床治疗提供实验依据。方法:1.基于GEO数据库下载有关mi R-152-3p的数据,分析mi R-152-3p在正常卵巢组织,卵巢癌组织以及卵巢癌亲本细胞和紫杉醇耐药卵巢癌细胞的差异表达;基于TCGA数据库筛选mi R-152-3p的临床卵巢癌患者的数据,明确mi R-152-3p表达与临床特征的联系。2.紫杉醇耐药卵巢癌细胞（A2780T）的鉴定和验证mi R-152-3p在卵巢癌亲本细胞（A2780）和A2780T细胞中的差异表达。（1）紫杉醇（20、15、10、5、2.5μg/m L）处理卵巢癌亲本细胞A2780和紫杉醇耐药细胞A2780T 48小时后,采用MTT法检测其细胞活力,计算两株细胞系的IC50以及耐药指数;（2）蛋白免疫印迹法（Western blot）分析检测耐药蛋白P-gp的表达情况;（3）q PCR检测mi R-152-3p在卵巢癌亲本细胞和紫杉醇耐药卵巢癌细胞中的表达差异。3.验证mi R-152-3p在卵巢癌细胞中的作用。（1）通过脂质体瞬时转染技术在A2780细胞和A2780T细胞分别转染mi R-152-3p mimics和mi R-152-3p inhibitor,转染杂乱序列作为阴性对照组,q PCR技术检测转染效率;（2）MTT法检测转染后细胞的增殖、IC50值的变化;（3）Western blot分析检测P-gp和GSTP1的表达情况;（4）流式细胞术分别检测转染mi R-152-3p mimics和mi R-152-3p inhibitor后,A2780细胞和A2780T细胞凋亡情况;（5）Western blot检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达。4.验证mi R-152-3p参与A2780T细胞自噬。（1）紫杉醇处理A2780T细胞和A2780细胞,Western blot分析检测自噬相关蛋白LC3II、p62的表达情况;（2）透射电镜观察A2780T细胞和A2780细胞中自噬小体的数目,观察紫杉醇是否诱导A2780T细胞自噬;（3）通过瞬时转染技术敲减A2780T细胞中mi R-152-3p的表达,Western blot分析检测自噬相关蛋白LC3II、p62的表达情况。5.验证mi R-152-3p调控PTEN参与A2780T细胞对紫杉醇耐药。（1）生物信息学预测mi R-152-3p的自噬靶基因;（2）q PCR技术检测靶蛋白在A2780细胞、A2780T细胞中的表达情况;（3）Western blot分析PTEN和ATG4D在转染之后的表达情况。6.验证敲减PTEN促进A2780T细胞对紫杉醇的敏感性。（1）通过瞬时转染技术降低A2780T细胞中PTEN的表达,分为阴性对照组（NC组）和转染组（si RNA组）;（2）q PCR技术检测转染效率;（3）MTT法检测转染后细胞增殖、IC50值的变化;（4）Western blot分析检测P-gp、MRP1和ABCG2的表达情况。结果:1.从GEO数据库中鉴定出mi R-152-3p在卵巢癌组织和紫杉醇卵巢癌耐药细胞中高表达;从TCGA数据库数据分析,mi R-152-3p与卵巢癌肿瘤的大小显著性相关。2.紫杉醇处理后,A2780T细胞与A2780细胞活力显著降低,计算出A2780T细胞的IC50值为（3.36±0.63）mg/m L,A2780细胞的IC50值为（0.17±0.064）mg/m L,耐药指数为19,A2780T细胞中的P-gp表达明显高于A2780,结果说明A2780T细胞是紫杉醇耐药卵巢癌细胞;q PCR法检测A2780T细胞中mi R-152-3p的表达量是A2780细胞的52倍,结果表明与生物信息学分析结果一致。3.通过脂质体转染技术降低A2780T细胞中mi R-152-3p的表达,抑制A2780T细胞增殖,IC50值下降,A2780T细胞中耐药蛋白P-gp和GSTP1表达降低;过表达A2780细胞中的mi R-152-3p,促进A2780细胞增殖,IC50值升高,GSTP1表达升高,P-gp几乎无表达,结果说明mi R-152-3p促进卵巢癌细胞增殖和对紫杉醇的耐药。流式细胞术结果显示:沉默A2780T细胞中的mi R-152-3p,促进细胞凋亡;在A2780细胞中过表达mi R-152-3p,抑制细胞凋亡;Western blot结果显示:沉默A2780T细胞中的mi R-152-3p,Bax表达增加,Bcl-2表达降低;而在A2780细胞中呈现相反趋势,结果说明mi R-152-3p能抑制卵巢癌细胞凋亡。4.随着紫杉醇给药浓度增加,自噬相关蛋白LC3II在A2780T细胞中表达增加,p62表达降低,在A2780中表达无明显差异;使用自噬抑制剂氯喹,LC3II表达增加,p62表达增加;透射电镜显微观察,在紫杉醇刺激或不刺激的情况下,A2780T细胞中的自噬小体数目均高于A2780,结果说明紫杉醇诱导A2780T发生自噬;敲减A2780T细胞中mi R-152-3p,LC3II表达降低,p62表达升高,结果说明mi R-152-3p促进A2780T细胞自噬。5.使用mi RDB、Targetscan、mi RWalk、HADB四个数据库分析,生物信息学预测mi R-152-3p的靶基因是:PTEN、ATG4D、CANX、GRID2。q PCR结果显示相比A2780细胞,PTEN、ATG4D在A2780T细胞中高表达;敲减mi R-152-3p,PTEN和ATG4D在m RNA水平和蛋白水平上表达降低,结果说明PTEN、ATG4D受mi R-152-3p正向调控。6.q PCR法验证了在A2780T细胞中瞬时转染si PTEN后,相比NC组,PTEN在A2780T细胞中的表达降低了60%。MTT结果显示:当A2780T中PTEN被敲减,A2780T细胞的的IC50值降低;Western blot结果显示:耐药蛋白P-gp、MRP1、ABCG2的表达降低,结果说明敲减PTEN增强A2780T细胞对紫杉醇的敏感性。结论:1.mi R-152-3p在A2780T细胞中高表达,促进A2780T细胞增殖,抑制A2780T细胞凋亡,增强A2780T细胞对紫杉醇的耐药性。2.mi R-152-3p正向调控PTEN促进A2780T细胞自噬,敲减PTEN增强A2780T细胞对紫杉醇的敏感性。